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Introducción
La leucemia mieloide aguda (LMA) es un desorden heterogéneo y complejo, que se encuentra caracterizado por la proliferación clonal de células progenitoras hematopoyéticas mieloides en médula ósea, sangre u otros tejidos 1,2. Representa el 1 % de todos los tipos de cáncer y es la leucemia más común en adultos 3.
La etiología de la LMA se encuentra asociada al desarrollo de mutaciones genéticas que se encuentran asociadas con el pronóstico del paciente. Las características genéticas y moleculares identificadas al diagnóstico, son fundamentales en los sistemas actuales de clasificación y estratificación de riesgo, siendo esenciales para la selección del tratamiento 4-6.
Avances en las tecnologías de diagnóstico han permitido la identificación de marcadores moleculares que han impulsado la implementación de la medicina de precisión en esta área. Dentro de los marcadores moleculares que permiten la estratificación de los pacientes en grupos de riesgo, y consecuentemente un tratamiento dirigido y específico, se encuentran los rearreglos de fusión y la presencia de mutaciones somáticas 7-9.
Entre las mutaciones somáticas más comunes en la LMA, se encuentran las que afectan al gen NPM1, que representan el 30 % al 35 % de los casos 10. El gen NPM1, codifica para la proteína nucleofosmina (NPM1). Esta proteína se localiza principalmente en el núcleo de las células y cumple funciones en el mantenimiento de la estabilidad genómica, la respuesta al stress dependiente de la proteína P53, la modulación del crecimiento celular y la biogénesis ribosomal. Las mutaciones más comunes que afectan a este gen consisten en duplicaciones o inserciones de 4 pares de bases en el exón 12. Estas mutaciones afectan el transporte de la proteína al citoplasma, lo que produce una pérdida de función de la proteína normal y una ganancia de función de la proteína mutada 11. Según las recomendaciones European Leukemia Net (ELN 2022), la presencia de mutaciones en este gen, es considerada de riesgo favorable y de buen pronóstico 12.
En la LMA, las mutaciones en el gen NPM1 son consideradas como “driver mutations”, es decir, son mutaciones conductoras del proceso de oncogénesis. No actúan aisladamente, sino en conjunto con mutaciones en otros genes, como por ejemplo los genes IDH1 e IDH2 13.
Las mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 ocurren en el 20-30 % de los casos de las LMA del adulto, el 6 al 16 % en el gen IDH1 y 8 a 19 % en el gen IDH2 14,15. Estas mutaciones afectan aminoácidos que se encuentran en el sitio activo de las enzimas isocitrato deshidrogenasas IDH1 e IDH2. Estas enzimas cumplen un papel esencial en el ciclo del ácido cítrico produciendo la conversión de isocitrato en alfa-cetoglutarato. Mutaciones en estos genes les otorga a las enzimas una ganancia de función que resulta en la conversión y acumulación de alfa-cetoglutarato en el oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG) 15.
Las mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 no se encuentran consideradas en las guías internacionales ELN 2022 para la estratificación de pacientes en grupos de riesgo. Sin embargo, la importancia de su detección, radica en la existencia de tratamientos con inhibidores dirigidos contra las proteínas anómalas IDH1 e IDH2 12.
Actualmente, no se cuentan con datos publicados en Paraguay con respecto al perfil de mutaciones en los genes NPM1, IDH1 e IDH2. Así, el objetivo del presente estudio fue identificar y describir el tipo de mutaciones presentes en estos genes en pacientes paraguayos con diagnóstico de LMA.
Metodología
Se realizó un estudio de carácter retrospectivo epidemiológico molecular en muestras anonimizadas de pacientes con diagnóstico de LMA, que acudieron al Departamento de Genética Molecular del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de Asunción (IICS-UNA) para el estudio de la mutación NPM1 entre los años 2016 al 2020. Estas muestras pertenecen al biorepositorio del Laboratorio. Se incluyeron en el estudio muestras de médula ósea provenientes de pacientes paraguayos mayores de 18 años con diagnóstico confirmado de LMA y portadores de la mutación NPM1. Se excluyeron aquellas muestras que presentaban material genético degradado.
a. Extracción y cuantificación del ADN
El ADN genómico se obtuvo a partir de muestras de medula ósea empleando el kit de purificación de ADN Wizard Genomic DNA Purification (Promega-EUA). La cuantificación del ADN obtenido se midió por fluorometría con el kit Qubit® dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen-EUA). La concentración de ADN utilizada fue de 20 ng/L.
b. Detección de mutaciones en el gen NPM1
Para la detección de mutaciones en el gen NPM1, se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real siguiendo el protocolo adaptado descrito por Gorello y cols 16. Fueron consideradas como positivas aquellas muestras que presentaron valores de CT≤35 en duplicado. En la Figura 1 se ilustran las curvas de amplificación por PCR en tiempo real.
Figura 1 Curva de amplificación de la mutación a en el gen npm1 mediante la técnica pcr en tiempo real
c. Detección de variantes en los genes IDH1 e IDH2.
Para la detección de mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 se siguió el protocolo adaptado descrito por Rakheja y cols 17. Se utilizó el método de secuenciación por Sanger, para lo cual se amplificó el exón 4 de estos genes por PCR convencional. El producto de la amplificación se envió a la empresa Macrogen-Corea para la secuenciación. Los resultados se analizaron mediante el análisis de los electroferogramas obtenidos y el programa bioinformático BioEdit versión 7.2.5 (32/64-bit). En la Figura 2 se ilustran los electroferogramas obtenidos a partir de la secuenciación Sanger del gen IDH1.
d. Análisis de datos
Los datos obtenidos fueron consignados a una planilla electrónica Microsoft Excel. Se utilizó estadística descriptiva para el análisis de los datos, mediante el paquete estadístico Graph Pad Prism versión 10.0.3.
e. Asuntos Éticos
En el presente estudio se respetaron los principios éticos en investigación en seres humanos de acuerdo a la declaración de Helsinki. Los datos de los pacientes fueron manejados de manera confidencial, salvaguardando la identidad de los pacientes, utilizando códigos para la identificación de las muestras. El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité Ético - Científico IICS-UNA con código P33/2015.
Resultados
Características demográficas y clínicas de los pacientes en estudio
Fueron incluidas 32 muestras de pacientes que presentaron resultado positivo para la detección de mutaciones en el gen NPM1. El 47 % de los pacientes estudiados (15/32), fueron remitidos del Hospital de Clínicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Asunción (HC-FCM-UNA), el 47 % (15/32) del Hospital Central Dr. Emilio Cubas del Instituto de Previsión Social (IPS) y el 6 % (2/32) de otros centros.
La mediana de la edad de los pacientes fue de 59 años (rango 19-85 años). El 47 % (15/32) fue del sexo femenino y el 53 % (17/32) del sexo masculino. Las características clínicas presentes al momento del diagnóstico se describen en la Tabla 1.
Mutaciones en el gen NPM1.
Se detectó la presencia de tres tipos de mutaciones. En el 94 % (30/32) de los pacientes se observó la mutación NPM1 tipo A, que corresponde a una duplicación de 4 nucleótidos TCTG en la posición 860_863 del ADN codificante (c.860_863dupTCTG). En el 3 % (1/32) la mutación NPM1 tipo B, que corresponde a una inserción de cuatro nucleótidos CATG en la posición 863_864 (c.863_864insCATG) y, en el 3 % (1/32) el tipo D que corresponde a una inserción de cuatro nucleótidos CCTG, en esta misma posición (c.863_864insCCTG). La mutación NPM1 A produce un cambio en el marco de lectura del gen que lleva a la formación de un codón de terminación prematuro y a la conformación de una proteína truncada. Las mutaciones NPM1 B y NPM1 D también producen un cambio en el marco de lectura del gen lo que conduce a una proteína anómala. En la tabla 2 se describen las mutaciones detectadas y el impacto que producen en las proteínas que codifican.
Estudio de mutaciones en los genes IDH1 e IDH2.
En el 40 % (13/32) de los pacientes se detectaron mutaciones en los genes IDH1 o IDH2. El 12 % (4/32) en IDH1 y el 28 % (9/32) en IDH2.
Los tipos de mutaciones observadas en el gen IDH1 consistieron en mutaciones con cambio de sentido. En 3 pacientes, se observó una mutación puntual en la posición 394 del gen, produciéndose el cambio de una citosina por timina, adenina y guanina. En un paciente la mutación se produjo en la posición 395, con un cambio de guanina por adenina (Tabla 2). En el gen IDH2 se detectaron dos tipos de mutaciones, ambas con cambio de sentido. En 7 pacientes se observó un cambio de guanina por adenina en la posición 419 y en dos pacientes un cambio de guanina por timina en esta misma posición (Tabla2). No se observó ningún paciente positivo para la mutación IDH2R172.
El perfil de co-ocurrencia de mutaciones entre los genes NPM1 e IDH1/2 se presentan en la Tabla 3. El perfil con mayor frecuencia se observó entre mutaciones en los genes NPM1 e IDH2 (28 %). En ningún caso se observó co-ocurrencia entre las mutaciones en los genes IDH1 e IDH2.
Discusión
En la LMA, las mutaciones que afectan al gen NPM1 se presentan en el 98-99 % de los casos en el exón 12, y raramente (aproximadamente el 1 %) en los exones 6, 9 y 11. A la fecha, se han descrito aproximadamente 55 tipos diferentes de mutaciones que afectan al exón 12, siendo la más frecuente la NPM1 A (80% de los casos), seguida de la NPM1 B (10%) y NPM1 D (5 %) 18. En el presente estudio el 93 % (30/32) de los pacientes presentaron la mutación NPM1 A. Para la detección de estas mutaciones se empleó la técnica de PCR en tiempo real según el protocolo de Gorello et al 16, que utiliza cebadores específicos para cada tipo de mutación, por lo cual en la población estudiada fueron detectadas solo estos tres tipos de mutaciones. Otros métodos como el de secuenciación masiva en paralelo o Next Generation Sequencing (NGS) permitirían identificar otras mutaciones en el exón 12; sin embargo, consideramos que el método utilizado es útil y aplicable en nuestro medio, debido a que solo presentaría un subregistro de mutaciones NPM1 no A, no B y no D equivalente a 1-2 % de los casos.
La importancia del estudio de mutaciones en el gen NPM1 se debe a características relevantes como: que son mutaciones específicas y frecuentes de la LMA, que no dirigen la hematopoyesis clonal premaligna y que surgen como eventos cooperativos en forma tardía 19,20. Así, la LMA NPM1mut es reconocida como una entidad clínica única por la Clasificación del Consenso Internacional 2022 (ICC 2022) 7 y por la clasificación de la Organización Mundial de la Salud en su quinta edición 21. Su presencia es de buen pronóstico y se encuentra asociada con mayor tasa de supervivencia global, mayor tasa de supervivencia libre de enfermedad y menor tasa de incidencia acumulada de recaída 22.
La presencia de mutaciones en este gen en la remisión es indicador de enfermedad activa 20, por lo que la guías internacionales ELN recomiendan su determinación, no solo para el diagnóstico del paciente, sino también para el seguimiento del tratamiento mediante la Enfermedad Residual Mínima (ERM) 23,24. La presencia de estas mutaciones en la post-inducción, permite refinar la estratificación de los grupos de riesgo y seleccionar a los pacientes candidatos de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas 20,25.
En relación a los genes IDH1 e IDH2, en el 40 % (13/32) de los pacientes estudiados se detectó alguna mutación, 12 % (4/32) en el gen IDH1 y 28 % (9/32) en IDH2. El 100 % (13/13) de las mutaciones detectadas se observaron en los sitios “hotspots” (o sitios calientes) de mutaciones. Estos sitios involucran al aminoácido Arg en la posición 132(IDH1R132) y al aminoácido Arg en la posición 140 y 172 (IDH2R140 e IDHR172) de las proteínas IDH1 e IDH2. La mutación que se presentó con mayor frecuencia (7/13-54 %) correspondió al gen IDH2 produciendo un cambio de Arg por Gln en la posición 140 de la proteína. No se detectó ninguna mutación en la posición IDH2R172 lo que se encuentra en concordancia con lo descrito en la literatura que relata que la mutación IDH2R172 y mutaciones en el gen NPM1 son mutuamente excluyentes 26,27.
Hasta la fecha, no existe evidencia suficiente para la inclusión del estudio de mutaciones en IDH1/IDH2 en las guías internacionales para la clasificación de grupos de riesgo. Sin embargo, la importancia de su estudio radica en que en la última década han surgido tratamientos dirigidos contra las proteínas anómalas producidas por mutaciones en estos genes. En este contexto la FDA aprobó el uso de enasidenib para el tratamiento de pacientes con mutaciones en IDH2 28, así como ivosidenib y olutasidenib para aquellos con mutaciones en IDH1 29,30.
En el presente estudio observamos que el 41 % (13/32) de los pacientes presentan un perfil mutacional de co-ocurrencia entre los genes NPM1 e IDH1/2. Los perfiles de co-ocurrencia y su frecuencia corresponden a lo descrito en la literatura, siendo el grupo más frecuente el NPM1mut/IDHno mut, seguido por NPM1mut/IDH2 mut y NPM1mut/IDH1 mut 31,32. El pronóstico de los pacientes que presentan co-ocurrencia de mutaciones en los genes NPM1 e IDH1 e IDH2 es controversial y variable. Estudios demuestran que el perfil de co-ocurrencia entre estas mutaciones es de mal pronóstico, mientras que otros presentan resultados favorables 32-34.
En Paraguay, existen pocos datos publicados en relación al perfil mutacional de los pacientes con LMA. Sin embargo, el estudio de mutaciones en los pacientes con sospecha de esta enfermedad, se encuentra en el algoritmo diagnóstico utilizado actualmente en nuestro medio. Así, esperamos que el presente estudio contribuya al conocimiento de marcadores moleculares en pacientes paraguayos.
