Introducción

Los arbovirus trasmitidos principalmente por mosquitos Aedes aegypti (Insecta, Culicidae) constituyen actualmente un reto a nivel mundial y la región de las Américas es la zona geográfica con gran impacto frente a estas enfermedades, considerando que para dengue en el 2023 se notificaron más de 4,2 millones de nuevos casos ¹. La fiebre dengue está ampliamente extendida y se ha documentado la transmisión autóctona del virus (DENV) en todos los países americanos excepto en Chile y Uruguay ².

En Paraguay, se han detectado los cuatro serotipos y en algunas temporadas circulan múltiples serotipos, incluido el DENV-1 genotipo V, DENV-2 genotipo III y el DENV-4 genotipo II ³. Si bien los departamentos Central y Cordillera son endémicos para dengue, en el año 2023 también se reportó un aumento inusual de casos de chikungunya en el país, siendo éste el mayor brote en los últimos años, con 55.508 y 3.312 en los departamentos Central y Cordillera respectivamente ⁴. Ambos departamentos están geográficamente ubicados en la región del Chaco húmedo, son limítrofes y mantienen un alto intercambio comercial y turístico, lo cual facilita la migración vectorial.

El vector principal, Ae. aegypti es un insecto, preferencialmente antropofílico muy asociado a ambientes antrópicos, el cual presenta alto grado de infestación intradomiciliar en áreas de gran densidad poblacional humana, durante los meses cálidos y lluviosos ⁵.

Esta especie ha sido identificada como vector del dengue, chikungunya, Zika y fiebre amarilla, todas de gran relevancia en salud pública. Posee una amplia distribución especialmente debido a factores como la urbanización descontrolada, el crecimiento poblacional, el cambio climático, las rutas migratorias, los diferentes factores sociales y principalmente la falta de control ^6,7. Estos factores han condicionado el incremento de la expansión y la densidad del mosquito, y consecuentemente de la transmisión del virus, que puede ser intra y peridomiciliar ⁸.

La variabilidad poblacional de Ae. aegypti es susceptible a cambios climáticos, movilidad de grupos humanos y selección por insecticidas. El conocimiento de estos factores contribuye a la comprensión de su dinámica poblacional y abre la interrogante acerca de su estructura, lo cual facilita la estimación de los cambios genéticos entre las poblaciones de vectores, su capacidad de infección y transmisión, así como las respuestas evolutivas a cambios ambientales ^9-11.

Los avances sin precedentes de la biología molecular, en particular los que incluyen la tecnología de marcadores de ADN, han generado una riqueza de conocimientos con aplicaciones útiles en ecología y genética de poblaciones de mosquitos. Varios marcadores moleculares han servido para la diferenciación y estructura genética entre poblaciones de vectores, entre ellos se destacan los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats), los polimorfirmos de longitud de los fragmentos amplificados (Amplified Fragment Length Polymorphism) o AFLP, las repeticiones de secuencia simple intergénica (ISSR) e isoenzimas ^12-14.

Los marcadores ISSR, son especialmente valiosos para detectar variaciones de ADN entre regiones de microsatélites. Son económicos y fáciles de utilizar, poseen elevado polimorfismo que permiten obtener los niveles de variación que se puedan encontrar en las poblaciones ¹⁵.

En el presente trabajo se propuso estimar la diversidad genética de las poblaciones de Ae. aegypti de los departamentos Central y Cordillera del Paraguay, utilizando los marcadores moleculares ISSR, con la intención de brindar información útil en la vigilancia entomo- epidemiológica y en el monitoreo de posibles eventos de nuevas adaptaciones y resistencia al control químico.

Metodología

Obtención de material biológico

El estudio fue descriptivo de corte transversal, con muestreo por conveniencia. Se colocaron ovitrampas en áreas peri domiciliares de 20 viviendas de cada departamento, con características ad hoc para la presencia del vector, tales como vegetación circundante, presencia de animales domésticos, áreas húmedas y sombreadas, presencia contenedores de agua y/o enseres acumulados que servirían de potenciales criaderos del mosquito. Se incluyeron los departamentos Central y Cordillera que representan sitios endémicos y diferentes zonas geográficas de Paraguay. Las ovitrampas fueron transportadas al laboratorio y se generaron colonias independientes para cada localidad, las larvas fueron criadas en condiciones controladas de humedad (80 %) y fotoperíodo de 12 horas, hasta ser conducidas a su fase adulta, para después ser clasificadas taxonómicamente como Ae. aegypti ¹⁶.

Para obtener el material genético, se seleccionaron 20 hembras emergentes de cada departamento, a las cuales se les extrajo el ADN, utilizando resina Chelex al 5 %, siguiendo el protocolo estandarizado en el laboratorio por Brítez y cols. ¹⁷. Para ello cada mosquito fue homogenizado en 240uL de la resina y 40uL de solución salina de NaCl 0,1M, utilizando un homogenizador (Sigma Aldrich, USA).

Amplificación por PCR:

De acuerdo a Soliani y cols. ¹³ se llevó a cabo la reacción de amplificación por PCR, habiendo sido seleccionados como cebadores a Rhea-4, ISSR-7, Ae-ISSR2, Ae-ISSR-6, ISSR1 y Pao-3 (Tabla 1), en un volumen final de 25 µL, que contenía 0,2 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl2, 1X de Buffer MgCl2, 0,4 µM de cada uno de los cebadores, 0,096 µg de BSA, 1 U de enzima Taq DNA Polimerasa termoestable (Taq DNA Polymerase Recombinant, Invitrogen) y 100 ng de ADN genómico. Las condiciones de ciclado implicaron un ciclo inicial de desnaturalización a 94ºC por 4 minutos, seguida de 35 ciclos a 94ºC por 45 segundos, hibridación Tm(°C) variable por 2 minutos como se detalla en la Tabla 1, extensión a 72ºC por 1 minuto y 30 segundos, y una extensión final a 72 ºC por 10 minutos. Aproximadamente el 25 % de los individuos de cada población fueron amplificados dos veces en diferentes días para confirmar la reproducibilidad.

Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2 % en tampón TBE 0,5X a 100 voltios durante 2 horas. Para la verificación de tamaño de los amplicones, se utilizó el marcador de tamaño molecular de 1 Kb (Thermo Scientific, USA). El gel se visualizó bajo luz UV (312 nm) después de la tinción con bromuro de etidio.

Tabla 1 Secuencia de seis cebadores de oligonucleótidos issr para determinar la variabilidad genética en poblaciones de aedes aegypti de los departamentos central y cordillera, Paraguay. 

Estimación de polimorfismo y análisis poblacional

Los datos recogidos en Microsoft Excel, versión 2013, permitieron construir una tabla de frecuencia de alelos, (se registró como presencia/ausencia de bandas en un locus particular), asumiendo que cada banda de un determinado tamaño molecular resultó del producto de un alelo dominante en un locus dado. A partir de estos datos binarios, se determinó la diversidad genética de las poblaciones mediante un análisis de varianza molecular (AMOVA) con 1000 permutaciones mediante el programa Arlequín 3.5 (versión 2.2) por el cual se estimó el porcentaje de la variación genética total, atribuible a variaciones intra e interpoblacional. Adicionalmente se estimó la diferenciación genética por pares FST bajo la hipótesis nula de no diferenciación entre poblaciones.

Consideraciones éticas

El trabajo fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Investigaciones en Ciencias de Salud de la Universidad Nacional de Asunción, bajo código P36/2015. La colocación de las ovitrampas se realizó con previo consentimiento de los propietarios de las viviendas y de los predios visitados. Las muestras de insectos utilizadas fueron las mínimas necesarias para lograr resultados favorables y su manejo siguió las normas de bioseguridad establecidas en el insectario.

Resultados

Del total de seis cebadores ISSR probados, dos cebadores mostraron amplificaciones ineficaces o no fueron compatibles con el ADN del mosquito (Ae-ISSR-2 y Pao-3).

El análisis genético reveló bandas claras y reproducibles, como producto de PCR para cuatro cebadores; ISSR-7, Rhea-4, Ae-ISSR-6 e ISSR-1 en las cuales se contaron un total de 36 bandas polimórficas, cuyos tamaños se identificaron en un rango de 250 a 1500 pb.

Las amplificaciones evidenciaron perfiles de bandas, entre 7 y 11 loci por cebador con 90,91 % de loci polimórficos y sólo una banda resultó ser monomórfica en ambas poblaciones. En la Figura 1 se observan los perfiles de bandas con los cuatro cebadores que mostraron reproducibilidad y nitidez.

Figura 1 Patrones de bandas issr obtenidos con distintos cebadores en las poblaciones de ae. Aegypti de central y cordillera 

El análisis AMOVA determinó que el 95,67 % de la variación genética se debe a diferencias intrapoblacionales, mientras que solo el 4,33 % es atribuible a diferencias entre poblaciones.

Por otra parte, se observó diferenciación genética moderada entre las poblaciones de Ae. aegypti procedentes de Cordillera y Central, demostrada por el índice de fijación (FST 0.0432) (p= 0.08016 ± 0.00872); los valores infieren que éstas poblaciones de mosquitos vectores no están completamente aisladas genéticamente.

Discussion

La diversidad genética de las poblaciones puede estar condicionada por factores relacionados a cambios ambientales naturales o por actividades antrópicas sobre la dinámica poblacional. El presente estudio es el primero en el que se registra el uso de marcadores ISSR para el análisis genético de poblaciones de Ae. aegypti de dos departamentos de Paraguay. Esta técnica relativamente sencilla arrojó patrones altamente polimórficos y repetibles, que nos permitieron identificar la diversidad a una escala geográfica de aproximadamente 60 km.

El conocimiento de la diversidad genética dentro y entre las poblaciones de Ae. aegypti, un vector clave de las arbovirosis que afecta de manera importante a la salud pública en todo el continente americano, especialmente en el Cono Sur, es esencial. Esta información permitiría evaluar características de la especie y plantear mejoras en la eficacia de los programas de control. De esta manera, las estrategias de control vectorial podrían ser diseñadas en función de lo que revela la composición genética y la diversidad de la población local de mosquitos ^18,19.

En este estudio, la diversidad intrapoblacional alcanzó un 95,67 % de variación. El alto porcentaje observado podría deberse a la heterogeneidad presente en los departamentos con zonas semi-rurales y urbanizadas, así como al establecimiento de subpoblaciones entre los sitios muestreados.

Por lo tanto, se sugiere que en futuros estudios sobre el vector Ae. aegypti se realicen muestreos a una escala geográfica más reducida. Además, es importante destacar que el vuelo de Ae. aegypti está condicionado por la disponibilidad de sitios adecuados para la oviposición y la alimentación, y que las hembras no suelen alejarse mucho de sus lugares de reproducción ^20,21.

La diferenciación moderada entre poblaciones (FST 0.0432) refleja un flujo génico considerable entre las poblaciones de mosquitos de ambos departamentos geográficos. Aunque existe alguna diferenciación, esta no permite inferir aislamiento genético, posiblemente debido a que la región de coincidencia limítrofe sea un ecotono o a que estas poblaciones de Ae. aegypti comparten una historia evolutiva reciente ²². Dueñas y col. han señalado que en Argentina el efecto del comercio entre regiones ha condicionado el intercambio genético entre poblaciones de Ae. aegypti, y han referido que las poblaciones de ese país comparten haplotipos con países vecinos endémicos para el dengue, tales como el Paraguay ²³.

En los departamentos Central y Cordillera, se sugiere que las poblaciones humanas son responsables del movimiento de los vectores debido a la movilidad diaria de los habitantes de Cordillera hacia Central por razones laborales. Además, el frecuente traslado hacia Cordillera, un corredor turístico importante enfocado en costumbres religiosas y culturales también contribuye a este fenómeno. Esta situación de intercambio turístico y/o laboral favorece el traslado humano local, junto con la migración pasiva de los vectores asociados, lo que como consecuencia conduce al aumento del riesgo epidemiológico frente a la transmisión de diversos casos de infección por arbovirus.

Algunos autores indican que en América se han dado fluctuaciones de las poblaciones de Ae. aegypti en función a fuertes campañas de control vectorial conducentes a erradicación con persistencia de poblaciones relictas post campaña. Sin embargo tales poblaciones vectoriales, en comparación con las mostradas en este estudio, poseen altos niveles de diversidad genética ^19,23.

Lo expuesto anteriormente plantea la necesidad de realizar seguimientos sistemáticos de los patrones de resistencia y susceptibilidad a larvicidas y adulticidas de las poblaciones de mosquitos de Cordillera, como se ha realizado en el departamento Central ²⁴. En este sentido, la alta diversidad intrapoblacional encontrada en las poblaciones del departamento Central, sugiere que a pesar de la aplicación continua de diversas estrategias de control químico, las poblaciones de mosquitos vectores no han sido completamente eliminadas. Por otro lado, se debe mencionar que son escasos los estudios poblacionales que involucren al vector Ae. aegypti en regiones fronterizas y áreas de puertos, zonas donde se esperan migraciones continuas de gran diversidad de insectos. En Paraguay, se registró recientemente a una zona comercial y fronteriza ubicada en el departamento Central limítrofe con Argentina, como un área de permanente riesgo de transporte de elementos biológicos, incluyendo huevos de Ae. aegypti ^17,25 En este contexto, se hace necesario incrementar estudios que faciliten el conocimiento de la dinámica vectorial de Ae. aegypti y la transmisión de los virus entre diferentes regiones del país, principalmente durante los brotes epidémicos.

Finalmente, bajo la premisa de, presencia frecuente de factores que mantienen el riesgo epidemiológico, se debería considerar la incorporación de estrategias o modificaciones diferentes en el control vectorial, que sean aplicables a nivel nacional y sostenibles en el tiempo, como las basadas en el control biológico con actinobacterias formadoras de biopelículas o a través de la inoculación de cepas de la bacteria Wolbachia sp. en Ae. aegypti ^26,27.