Introducción

En los últimos años el uso de plaguicidas en los diferentes cultivos ha aumentado considerablemente, lo que conlleva a diferentes problemáticas, entre las que se encuentra afectada la salud humana. La cavidad oral refleja el estado de salud de los individuos, debido a que la mucosa que la recubre, puede presentar evidencias a nivel microscópico como macroscópico de cambios indicativos de enfermedad local sistémica o por exposición a sustancias tóxicas así como efectos secundarios por tratamientos (^{Hei y Filipic, 2004}). Debido a la exposición ocupacional los agricultores son los que poseen mayor riesgo de presentar daños en su material genético. Por ello la importancia de realizar el estudio en las células de la mucosa oral para evaluar el efecto genotóxico y citotóxico, de forma sencilla, rápida y económica; esto mediante la prueba de micronúcleos (MN) y detección de diversas anormalidades nucleares (AN) (^{Tolbert et al., 1992}). El epitelio de revestimiento oral (60%) es estratificado no queratinizado formado por células con abundante citoplasma, permite la penetración de colorantes y facilita la observación e identificación de características morfológicas del núcleo y membrana celular (^{Squier & Kremer, 2001}). Este epitelio es de fácil acceso, poco invasivo, por lo que al tomar la muestra a los individuos, se les genera mínimo estrés (^{Bonassi et al., 2011}). Por lo tanto el epitelio oral es un tejido excelente para aplicar la técnica de micronúcleos y detección de otras anormalidades nucleares sin necesidad de realizar otros tipos de técnicas más complicadas, lo que representa una oportunidad para realizar estudios epidemiológicos en poblaciones expuestas constantemente a algún mutágeno (^{Torres- Bugarín et al., 2000}). Los fenómenos genotóxicos o aberraciones más frecuentes son las células binucleadas (BN), los micronúcleos (MN), yemas nucleares (NBUD) y puentes nucleoplasmaticos (NPB) o dicéntricos, mientras que los derivados de fenómenos citotóxicos conllevan a muerte celular como en el caso de apoptosis, cariólisis, picnólisis y necrosis (^{Tejedor Cassiani, 2011}).

El Laboratorio de Mutagénesis, Carcinogénesis y Teratogénesis Ambiental Facultad de Ciencias Exactas y Naturales posee una amplia experiencia en cuanto a estudios de biomarcadores en mucosa bucal en personas expuestas a diferentes mutágenos. Se puede demostrar la trayectoria en evaluación de micronúcleos en los trabajos de monitoreo de poblaciones ocupacionalmente expuestas a otros contaminantes como los de ^{Segovia et al., (2007}). ^{Benítez-Leite, et al., (2010}) en una población infantil potencialmente expuesta a pesticidas, ^{Gómez Grance et al., (2010}) evaluación de micronúcleos en pacientes expuestos a cobaltoterapia y ^{Fernandez, et al. (2012}) con la evaluación genotóxica en pacientes con cáncer de tiroides sometidos a iodoterapia.

Metodología

Los grupos a ser evaluados fueron sometidos a una encuesta preliminar y firmaron una nota de consentimiento para participar del proyecto. Cada persona fue encuestada y a la misma se le explicó en detalle la investigación de la cual participa.

Antes a la toma de muestra las personas realizaron un enjuague bucal con agua corriente a fin de eliminar restos de alimentos. Se raspó con una paleta bajalenguas de madera cuidadosamente la parte interna de ambas mejillas, para la extracción de la mucosa bucal de las personas a ser estudiadas. Se realizó el extendido de la muestra tomada sobre un portaobjeto limpio (3 muestras por individuo) y se dejó secar al aire a temperatura ambiente. Se fijó el preparado en etanol absoluto durante 30 minutos y se dejó secar a temperatura ambiente durante 24 horas. Se realizó la hidrólisis en HCL 5N durante 30 minutos. Luego se colocó las muestras hidrolizadas, en reactivo de Schiff, siguiendo la técnica de Feulgen, durante 2 horas en ausencia de luz. Se lavaron las láminas con agua corriente, y se dejaron secar a temperatura ambiente. El análisis de las muestras consistió en comparar el grupo expuesto (n=22), grupo control (n=26). Se observaron 2000 células por individuo de cada grupo a ser estudiado (grupo caso y grupo control), en microscopios óptico con aumento de 1000x. Para establecer la frecuencia de micronúcleos y otras anormalidades del núcleo que se pueden distinguir de células normales por sus alteraciones ya sea en el citoplasma o en la morfología del núcleo, entre ellas se encuentran la cromatina condensada (CC), cariorrexis (CR), núcleo picnótico (NP), cariolisis (CL), núcleo lobulado también llamado prolongación nuclear, “bud cell” o “broken eggs” (NL, BE) y la presencia de células con dos núcleos, llamadas células binucleadas (BN).

Tabla 1 Análisis de varianza (ANOVA) con p-valor = 0,05 de significancia. 

Análisis estadísticos: el análisis estadístico de los datos se realizó usando el programa SPSS Statistics 23. Se comparó el grupo de personas expuestas con el de las no expuestas, en relación al comportamiento de cada una de las variables de la encuesta, usando un análisis de varianza univariado. Posteriormente, se aplicó una t de Student para comparar la significancia del daño en el ADN (test de Micronúcleos) entre ambos grupos.

Resultados y discusión

En relación a las anomalías celulares estudiadas mediante las entrevistas y toma de muestras de la mucosa bucal de las personas expuestas y no expuestas a algún tipo de plaguicidas, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos estudiados para la mayoría de las variables, tales como: Broken Egg, Pignosis, Cariorrexis y Binucleadas. Sin embargo, el grupo de personas expuestas presentan una diferencia estadística significativa en cuanto a Micronúcleos y Cariolisis (p<0,05). Tablas 1 y 2.

Los agricultores de frutilla de la ciudad de Areguá, presentaron mayores signos de daño celular de acuerdo a los análisis estadísticos, el grupo control es una población de trabajo leve, mayoritariamente en oficinas, estilo de vida saludable, sin consumo de alcohol ni exposición a cigarrillos.

Tabla 2.  Prueba T-Student para comparación de significancia de medias de los grupos control y expuesto. 

Se encontró un mayor número de células con MN (0,075%) y en cariolisis (0,85%) en los individuos expuestos, en comparación con las células de la población no expuesta a agroquímicos MN (0,03%) y en cariolisis (0,5%) respectivamente, con una p≤0.05 para la prueba de T-Student con una significancia de 0.040 para MN y 0.023 para cariolisis. Para las demás aberraciones como Cariorrexis (p=0.945), Broken egg (p= 0.298), Binucleadas (p= 0.670), Pignosis (p= 0.548) no se obtuvieron valores significativos como se puede observar en la Tabla 2.

En la Figura 1 se puede observar el promedio de las anormalidades celulares encontradas tanto en el grupo expuesto (izquierda) como en el grupo control (derecha). En la Figura 2 se observa el diagrama de caja y bigotes de las anomalías celulares.

Figura 1 Promedio de anomalías celulares de personas grupo control y expuesto. 

Figura 2 Diagrama de cajas y bigotes de las anomalías celulares. 

Los hábitos de no usar equipos de protección como: guantes, tapabocas, chalecos exclusivos para fumigación, sombreros durante la exposición prolongada al sol y calzados apropiados podrían inducir a la formación de micronúcleos y otras anomalías nucleares, siendo la más frecuente la cariolisis. Según estudios de ^{Martínez et al., (2017)} personas ocupacionalmente expuestas a ciertos agentes químicos y que no utilizan equipos de protección básica marcan un incremento significativo en frecuencias de células con anormalidades nucleares comparando con las de los controles, según estos autores la inhalación de los vapores de plaguicidas rociados en invernaderos influye en el resultado.

Conclusión

Basado en los resultados de los análisis estadísticos se verifica un incremento en el daño celular en personas ocupacionalmente expuestas a plaguicidas, si bien, la presencia de no garantiza que las personas desarrollarán algún tipo de enfermedad, es indicador de una inestabilidad celular, que sirve como monitoreo del daño genético ante este por riesgo ocupacional.

Además, cabe mencionar que el estilo de vida y la falta de rigurosidad en la implementación de equipos de protección pueden estar generando estos desfasajes entre el grupo control y el grupo expuesto. Los datos obtenidos también ayudaron a evaluar la calidad del ambiente laboral, así como concientizar a la población expuesta a adquirir buenas prácticas de manejo laboral en el momento de la fumigación.