Introducción

Las grandes pérdidas en el rendimiento de los cultivos y en la producción total se deben en gran parte al ataque de hongos filamentosos que generalmente se encuentran en los suelos cultivables (^{Jansen et al., 1995}; ^{Isidrón et al., 2003}). Debido a este fenómeno el empleo de sustancias fitosanitarias ha ido en aumento en los últimos años en nuestro país, y uno de los plaguicidas mayormente utilizado en zonas rurales son los fungicidas (^{Grabowski et al., 2014}). El fungicida de mayor índice de uso es el carbendazim, también empleado en pinturas sintéticas como preservante al igual que en industrias textiles y de curtiembres, pero el uso más relevante es en frutos con el fin de preservarlos (^{Selmanoğlu et al., 2001}). Este es de acción sistémica, de contacto y amplio espectro, su aplicación es principalmente foliar, de rápida acción, interfiriendo en la síntesis de ADN en la mitosis fúngica, actúa impidiendo el desarrollo de hifas, formación de apresorios y crecimiento del micelio (^{Soissa Stephens et al., 2005}). Se ha demostrado que el carbendazim administrado en ratas posee una farmacocinética favorable donde la mayor concentración hallada fue en el estómago e intestino menor, las concentraciones en tejido y sangre fueron en el rangos de 63 a 164 µg/g durante 4 horas, luego la concentración de este fungicida en sangre decae a niveles basales lo cual podría deberse a que el carbendazim posee un alto coeficiente de permeabilidad que va desde 7,74-8,06x10^-5 y 6,8-8,42x10^-5 cm/s, también se evidenció que el mismo se elimina en orina y en heces (^{Jia et al., 2003}).

No obstante, en estudios realizados en dosis de 0, 2.5, 5, 7.5 y 10 mg.kg^-1 de tierra, en A. cepa, el carbendazim ha inhibido el índice mitótico, generando anomalías cromosómicas en las células de dicho vegetal, esto es debido a los efectos citogenotóxicos del mismo (^{Paul et al., 2013}).

También se ha demostrado que este fungicida a dosis orales altas que se acercan a la dosis máxima tolerada de 1000 a 2000 mg.kg^-1.día^-1 durante 5 días en ratas Han-Wistar aumentaron los micronúcleos de la médula ósea y de las células de la sangre periférica, pero no causaron cometas en la sangre total o en el estómago (^{Bowen et al., 2011}). Otro trabajo ha confirmado el incremento en el número de óvulos abortados de D. magna), lo que, a su vez, eventualmente esté conectado con la inhibición de la mitosis durante la división de los huevos en la bolsa de cría, además de causar daños en el ADN de las dafnias (^{Ribeiro et al., 2011}; ^{Silva et al., 2015}). Asimismo, usando embriones de Danio rerio expuestos a este fungicida, la expresión de genes que están involucrados en el eje hipotalámico-pituitariogonadal / tiroideo (HPG / HPT) se reguló a la baja y los niveles de expresión de dos aromatasas del citocromo P450, CYP19a y CYP19b, aumentaron significativamente después de 20 y 100 μg.L^-1 de carbendazim respectivamente, lo cual denota el efecto de alteración endocrina de este compuesto (^{Jiang et al., 2014}). A su vez, tiene la capacidad de generar estrés oxidativo, comprobado con el aumento de la expresión de las enzimas CAT, GPX y Mn-SOD durante el desarrollo del pez cebra (Jiang et al., 2015).

Sin embargo, los estudios donde se evalúa la mutagenicidad de dicho plaguicida son muy escasos, es por esto que el objetivo principal de este estudio es evaluar la acción mutagénica del carbendazim (formulación comercial) en D. melanogaster mediante el test de mutación somática y recombinación.

Materiales y métodos

Preparación de las diluciones

Se preparó las diluciones según el uso popular del carbendazim (Composición en g.L^-1: 2-metoxicarbamoil-bencimidazol 5 g, agentes dispersantes y solvente 100 mL), para ello se realizaron 3 diluciones (1%, 5% y 10%) a partir de una solución stock de carbendazim 50%, la preparación se llevó a cabo con las medidas de bioseguridad sugeridas para su manejo en campana de gases.

Test de mutación y recombinación somática en alas de Drosophila melanogaster

Se obtuvieron 400 hembras vírgenes de cepas puras de Drosophila melanogaster (flr ³ /In(3LR)TM3, rip ^p sep I(3)89Aa bx ^34e y Bd ^S , las cuales se encontraban bajo condiciones normales de temperatura ambiente (22 -24° C) y medio de cultivo convencional (Harina de maíz 42 g, Agar-agar 6 g, Sacarosa 24 g, Levadura 26,5 g, Agua destilada 500 mL, 2 mL de Ácido propiónico-Ácido ortofosfórico 1:1 y 2 mL de solución Nipagin 1%).

También se obtuvieron, de frascos con medio de cultivo convencional, 200 machos de cepa pura mwh/mwh de D. melanogaster. El cruce estándar (SC) se realizó depositando en cada frasco 80 hembras vírgenes cepa flr ³ /In(3LR) TM3, rip ^p sep I(3)89Aa bx ^34e y Bd ^S con 40 machos de la cepa mwh/ mwh, por 72±5 horas (^{Graf et al., 1984}; ^{Graf et al., 1992}). Y fueron cultivadas en medio ovopositor por 72±5 horas a temperatura ambiente 22 -24° C (^{Graf et al., 1984}, ^{Graf et al., 1992}).

Transcurridas las 72±5 horas se procedió a la extracción de cien larvas de tercer estadio de cada frasco, las cuales fueron depositadas en diferentes contenedores con medio instantáneo (1,5 gramos de puré de papa instantáneo rehidratado con 5 mL con las diluciones del carbendazim 1%, 5% y 10%, agua destilada como control y Ciclofosfamida 0,3%) preparado en el momento de traspaso, para tratamiento vía oral por 72 horas (^{Graf et al., 1984}; ^{Raman & Paul, 2011}).

Una vez eclosionados los imagos fueron seleccionaron al azar 10 individuos trans-heterocigotas mwh+/+flr ³ de cada tratamiento (5 individuos por sexo), de las cuales se extrajeron las alas con ayuda de una lupa estereoscópica Carl Zeiss y montadas (20 alas por lámina y por tratamiento) con Solución de Faüre (Goma arábica 300 g, Glicerol 20 mL, Hidrato de Cloral 50 g, y Agua destilada 50 mL).

La observación de las láminas se realizó con ayuda de un microscopio óptico compuesto donde se observaron las regiones de las alas analizadas fueron solamente las A, B, C´, C, D´, D, E, y también los márgenes que separan a las mismas (^{Rodrigues de Andrade et al., 2004}).

Se cuantificó el número de clones mutantes en las alas observadas y se los clasificó según el tipo de marcador expresado; Manchas Simples Pequeñas (MSP) con una o dos células (mwh o flr ³ ), Manchas Simples Grandes (MSG) con más de tres células (mwh o flr ³ ) y Manchas Gemelas (MG) con un área mwh y otra flr ³ adyacente (^{Graf et al., 1984}; ^{Rodrigues de Andrade et al., 2004}).

Análisis estadístico de datos

La dosis letal 50 (DL₅₀) se determinó a partir de los datos obtenidos empleando el análisis Probit (^{Finney, 1952}). También se analizaron mediante tablas estadísticas de acuerdo con ^{Frei y Würgler (1988}), que corresponde a un modelo estadístico Binomial Condicional (Test de ^{Kastenbaum-Bowman) (Kastenbaum & Bowman, 1970}), con niveles de significancia α = β = 0,05 (Kastenbaum & Bowman, 1970), donde las frecuencias de mutaciones se utilizaron directamente en la determinación del valor mínimo de mutaciones. Los gráficos estadísticos fueron realizados empleando el programa Excel (Microsoft Office 2016, USA).

Resultados y discusión

La contabilización de los adultos eclosionados por cada 100 larvas da como resultado para el tratamiento Control un total de 94 individuos y con la Ciclofosfamida al 0,3% un total de 40 individuos. Para las diferentes concentraciones del carbendazim los resultados fueron los siguientes: al 1% el número total de individuos fue de 87, al 5 % un total de 34 individuos y al 10% un total de 25 individuos contabilizados. A partir de estos datos se ha determinado la dosis letal 50 (Fig. 1) de la sustancia empleada para este estudio que fue la concentración de 4,848%, hallándose linealidad y ajuste a la curva R² = 0,966.

Figura 1 Dosis letal y contabilidad de moscas adultas. A) Análisis Probit DL₅₀ de. B) Cantidada de imagos de Drosophila melanogaster por unidad de tratamiento. 

Estos resultados podrían indicar que a mayor concentración del fungicida se genera una disminución en la cantidad de individuos en la población tratada, cambiando la tasa de natalidad de imagos de las mismas, lo cual podría estar afectando también la estructura poblacional de estas. Esto concuerda con lo descrito por ^{Slijkerman et al. (2004}), quienes han demostrado en ensayos con organismos acuáticos como Daphnia magna, fitoplancton y zooplancton que altas concentraciones del fungicida produce cambios en la estructura poblacional de Daphnia magna y cambios en la estructura de las comunidades de zooplancton y fitoplancton.

A su vez, ^{Andrade et al. (2016}), usando Danio reiro (pez cebra) demostraron que el carbendazim es moderadamente tóxica para los embriones con una CL50 de 1,76 mg.L a 96 horas de exposición, en tanto, han visualizado efectos en el desarrollo de los embriones al desencadenar una serie de anomalías como ser la incidencia de edema, deformaciones de la columna vertebral, la cabeza y la cola, reducción de la frecuencia cardiaca, la longitud del cuerpo y la tasa de consumo del saco vitelino.

A las 24 horas, no causó mortalidad significativa pero los embriones expuestos a concentraciones superiores a 1,3 mg. L^-1 exhibieron deformidades en la cola y columna vertebral que presentaban un EC₅₀ de 1,48 mg.L^-1. A las 48 horas, se observó un incremento en la frecuencia de edemas, con una EC₅₀ que presentaban una EC50 de 1,53 mg.L . A las 72 horas, junto con el aumento de las malformaciones, se redujo la tasa de eclosión de embriones expuestos a una EC₅₀ . de 1,26 mg.L^-1 y curvatura de la columna vertebral que presentaban una EC50 de 1,53 mg.L-1.

A las 72 horas, junto con el aumento de las malformaciones, se redujo la tasa de eclosión de embriones expuestos a una EC50 de mg.L-1 y visualizaron malformaciones en la cabeza y los ojos, curvatura de la columna y edemas pericárdicos.

Los datos obtenidos en el tratamiento control evidenciaron un total de ocho clones mutantes, siendo estos siete del tipo MSP y uno del tipo MSG. Para el agente mutágeno empleado (Ciclofosfamida 0,3%) se contabilizando un total de 62 clones mutantes, 44 del tipo MSP, 13 del tipo MSG y 5 MG. En el tratamiento con el carbendazim 1% fueron nulos ya que no se observó ningún clon mutante (MSP, MSG y MG) en las alas de los individuos tratados. Para el tratamiento con carbendazim 5% se observaron un total de tres clones mutantes del tipo MSP, y ninguna del tipo MSG y MG. En el tratamiento del carbendazim 10% se observaron un total de siete clones mutantes, distribuidas en seis del tipo MSP, una del tipo MSG, y ninguna del tipo MG (Tabla 1, Fig. 2).

Estos resultados concuerdan con la hipótesis planteada en este estudio, ya que se encontraron una correlación entre el número de clones mutantes presentes y la concentración del fungicida, donde a bajas concentraciones no se observaron cantidades significativas de mutaciones lo que se ajusta a lo descrito por ^{Ilyushina (2020}), que empleando el método de electroforesis alcalina en gel unicelular (ensayo cometa), demostró que este fungicida de grado técnico no inducía daño al ADN en la médula ósea y las células hepáticas de ratones CD-1 en el rango de dosis de 62,5 a 2000 mg.kg^-1 de peso corporal.

Figura 2 Clones mutantes observados en alas de individuos mwh+/+flr ³ de Drosophila melanogaster tratadas con carben- dazim. A) Mancha simple pequeña de tipo mwh (flecha), tratamiento al 5%. B-C) Manchas simple pequeña tipo mwh (flechas), tratamiento al 10%. D) Mancha simple grande tipo mwh (elipse), tratamiento al 10%. 

En tanto, el carbendazim al 10% presenta efecto mutagénico tanto para los clones MSP y TM, lo que también fue demostrado por ^{Palanikumar et al. (2014}), mediante la observación de un aumento de los micronúcleos en los eritrocitos de Chanos (pez de leche) a mayor dosis de carbendazim, lo cual se ajusta a lo reportado por ^{Verma et al. (2018}) que mediante el estudio de raíces de Allium cepa observaron un incremento del daño citogenético relacionado con los días después de la aplicación y de la exposición al fungicida.

A su vez, ^{Salihu et al. (2015}) empleando 50 mg.kg^-1 en ratas Wistar machos adultos encontraron una disminución significativa en el recuento total de glóbulos rojos, linfocitos y plaquetas, pero hubo un aumento en el conteo de neutrófilos, además, observaron una elevación en todos los marcadores de daño hepático y renal en el plasma de ratas. El hígado de estas ratas mostró área focal de necrosis, leve dilatación de sinusoide con presencia de células inflamatorias, donde las células que recubren el conducto mostraban núcleos vesiculares y un aumento en la relación núcleocitoplamática. Por su parte, ^{Jiang et al. (2015}) expusieron larvas de pez cebra a concentraciones de 4, 20, 100 y 500 µg.L^-1 de carbendazim para 4 y 8 días, donde hallaron que los niveles de ARNm de catalasa, glutatión peroxidasa y manganeso superóxido dismutasa (Gato, GPX, Manganeso/SOD) aumentaron después de la exposición a diferentes concentraciones del fungicida durante estos días. La regulación al alza de P53, Apaf1, Cas 8 y la regulación a la baja de Bcl2, Mdm2, Cas 3 en la vía de la apoptosis, así como el aumento en la expresión de citoquinas y quimioquinas, incluyendo CXCL-C1C, CCL1, IL-1b, IFN, IL-8 y TNF α, sugirieron que este fungicida podría desencadenar la apoptosis y la respuesta inmunitaria durante el desarrollo de las larvas de pez cebra. Con estos datos, se podría decir que el carbendazim induce simultáneamente múltiples respuestas durante el desarrollo de las larvas del pez cebra y que podrían estar presentes en interacciones bidireccionales entre el estrés oxidativo, la vía de la apoptosis y los sistemas inmunitarios.

Los resultados obtenidos en este estudio también se ajustan a lo descrito por ^{Kara et al. (2019}) quienes determinaron que no hubo diferencias significativas entre los grupos con exposición a este fungicida en las células SHSY5Y, sin embargo, en las células NRK, el daño al ADN aumentó significativamente dependiendo de la dosis empleada.

Conclusiones

Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que al aumentar las dosis de concentraciones de carbendazim empleadas se puede observar una correlación entre las concentraciones del carbendazim y la cantidad de clones mutantes, detectándose a una alta concentración de 10% un potencial mutagénico a los individuos de D. melanogaster para dos de sus marcadores empleados (MSP y TM).

Se recomienda realizar una mayor exposición de los tratamientos a las larvas de D. melanogaster, también realizar otros bioensayos (test de micronúcleos en sangre periférica de Danio rerio, test cometa en D. melanogaster, y el análisis de alteraciones nucleolares en células meristemáticas de Allium cepa) a modo de reconfirmar con otros ensayos los resultados encontrados en este estudio.

Agradecimiento

Expresamos nuestro agradecimiento a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y al Rectorado de la UNA, por el apoyo otorgado para el desarrollo de esta investigación.

Fuente de financiamiento

Dirección General de Investigación Científica y Tecnológica de la Universidad Nacional de Asunción, mediante la firma en el año 2017.

Contribución de los autores

Los autores contribuyeron de igual manera en el desarrollo de la investigación y en la elaboración de este artículo.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de interés.