INTRODUCCIÓN

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los alimentos involucrados con más frecuencia en casos de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs) son aquellos de origen animal; entre ellos, se pueden mencionar la carne bovina, porcina y aviar; huevos, pescados, crustáceos, moluscos, o productos lácteos¹. Las ETAs contribuyen considerablemente a la cifra mundial de morbilidad y mortalidad. Existe evidencia que los alimentos pueden contaminarse en cualquier etapa del proceso de manufactura y causar enfermedad².

Los microorganismos que contaminan alimentos se multiplican en la luz del intestino produciendo toxinas o invadiendo la pared intestinal, desde allí puede posteriormente afectar a los otros órganos³.

Una de las principales causas de la contaminación biológica (por microorganismos) es la contaminación cruzada, que ocurre cuando los microorganismos de un alimento crudo, o sin estar correctamente desinfectado, se transfieren a otro alimento que ya está cocido y listo para el consumo⁴.

Uno de los focos principales de contaminación de alimentos son los mercados populares o de venta callejera, si los mismos no cuentan con sistemas de supervisión sanitaria y la posibilidad de contar con bajo nivel de cumplimiento de las normas higiénicas para la venta, que incluyen prácticas de riesgo de contaminación como que los manipuladores de los puestos de venta manejen los productos sin ninguna protección, mal manejo de la basura, y exposición a insectos que pueden posarse en los alimentos^5,6.

Se reconoce que la leche cruda y sus derivados lácteos constituyen un factor de riesgo para la infección o intoxicación con microorganismos patógenos de transmisión alimentaria principalmente como son la Salmonella spp, Staphylococcus sp.⁷. Según El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (Centers For Disease Control and Prevention, CDC) desde 1998 hasta 2018 hubo 202 brotes de toxiinfección alimentaria relacionados con el consumo de leche cruda. Estos brotes causaron 2.645 enfermedades y 228 hospitalizaciones⁸.

La producción de queso artesanal a partir de la leche cruda es una actividad tradicional en varias ciudades del Paraguay y si no se cumplen medidas estrictas de higiene durante su producción, transporte, conservación y expendio, es factible que el riesgo de contaminación con microorganismos pueda volverse una realidad⁹. El queso Paraguay es un alimento que forma parte de la canasta básica familiar, elaborado con metodología tradicional, utilizándose generalmente la leche cruda como materia prima y el cuajo de los rumiantes como medio coagulante. Sin los cuidados higiénicos apropiados en la materia prima, la producción o la mala conservación, puede favorecer la contaminación con microorganismos como: Listeria sp., Escherichia coli, S. aureus, entre otros¹⁰.

S. aureus es una bacteria anaerobia facultativa y que se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente. Su principal reservorio son los seres humanos y animales, encontrándose habitualmente en la piel y mucosas nasales de aproximadamente el 30% de la población humana a nivel mundial⁸, con el consecuente riesgo del desarrollo posterior de infecciones y la contaminación de alimentos manipulados por los portadores¹¹.

S. aureus es causante de intoxicación alimentaria ya que en el alimento se puede encontrar la toxina preformada¹². La intoxicación estafilocócica es el resultado de la ingestión de alimentos contaminados con cepa de S. aureus productores de enterotoxinas termorresistentes. Los productos implicados por lo general se contaminan a través de la manipulación de un operario portador de S. aureus aunque también puede estar presente en leche procedente de vaca con mastitis¹³. La ingestión de toxinas de S. aureus destaca por su periodo de incubación menor de 3 horas y manifestaciones clínicas como náuseas, vómitos intensos, espasmo abdominal y diarrea generalmente con evolución favorable entre 24 a 48 horas. pueden producirse formas graves que cursan con hipotensión, hipotermia y shock¹⁴.

Las enterotoxinas son proteínas globulares de cadena única con pesos moleculares que oscilan entre 22 y 29 kDa. Se han caracterizado 22 enterotoxinas que se designan en el orden cronológico de su descubrimiento. Las clásicas son SEA, SEB, SEC con las variantes (SEC1, SEC2 y SEC3) las SED y SEE se descubrieron en brotes de intoxicación alimentaria y se clasifican en distintos tipos serológicos y tras la secuenciación de genomas bacterianos se han revelado otras enterotoxinas que incluyen a SEG, SEH, SER, SES, SET, entre otras. Los tratamientos térmicos no son útiles para la destrucción de la enterotoxina¹⁰. Es necesario que el S. aureus se encuentre presente en los alimentos en una concentración alta de (105-108 UFC/g) para que se produzca suficiente cantidad de enterotoxina que puedan provocar los síntomas¹⁵.

El Instituto Nacional de Tecnología y Normalización (INTN) define al queso Paraguay como; el queso fresco elaborado a partir de leche entera pasteurizada y obtenido por coagulación enzimática de la leche con cuajo y/o otras enzimas coagulantes apropiadas, complementado con bacterias lácticas específicas¹⁶ Para poder evitar cualquier enfermedad transmitidas por alimentos debemos seguir las directrices básicas de las 5 claves descriptas por las organizaciones mundiales como la OPS, OMS¹⁶.

El presente trabajo buscó investigar las condiciones de comercialización de queso Paraguay y frecuencia de contaminación con Staphylococcus aureus enterotoxigénico en mercados Municipales de Asunción y gran Asunción.

MATERIAL Y MÉTODOS

El diseño del estudio fue observacional descriptivo prospectivo de corte transverso, con muestreo no probabilístico por conveniencia.

Colecta de muestras y análisis microbiológico

Se adquirieron de forma aleatoria 20 muestras de queso Paraguay, 10 provenientes de puestos de venta de un mercado municipal de la ciudad de Asunción, y otras 10 de puestos de venta de un mercado municipal de la ciudad de San Lorenzo. Durante el proceso de adquisición de los mismos, se inspeccionó visualmente el aspecto del local de expedición y de los vendedores, en cuanto a la vestimenta que portaban para la manufactura y venta del producto alimenticio. Esto se realizó mediante una planilla de verificación en la que destacan aspectos como: presencia de roedores e insectos visibles, presencia de tachos de basura, agua potable, aspecto y prácticas de higiene del manipulador de alimentos, entre otros. Para la recolección de datos relacionados con las BPM, se diseñó y validó una lista de verificación que contenía 10 variables, para ello se utilizó como guía las Normativas Internacionales y Nacionales, que dictan los lineamientos referentes a BPM.

Las 20 muestras de quesos fueron transportadas a 4°C hasta un Laboratorio de Bacteriología de San Lorenzo en frascos correctamente etiquetados e identificados. El flujograma del trabajo realizado en el laboratorio de Bacteriología se muestra en la Figura 1. En el procedimiento se utilizaron bolsas estériles de tipo Stomacher (Deltalab, Barcelona, España), agua peptonada al 10% (Britania, Argentina), placas Petri conteniendo medio de cultivo selectivo Baird-Parker (Condalab, España), y agar DNasa (Britania, Argentina).

La fórmula para calcular las UFC por mililitro (UFC/ml) fue: UFC/ml= (Número de Colonias Contadas) × (Factor de Dilución), en donde el Factor de Dilución fue 10 para cada dilución utilizada por cada placa sembrada con cada dilución.

Figura 1: Flujograma de trabajo para el aislamiento de S. aureus a partir de muestras de queso Paraguay. 

Las cepas aisladas e identificadas como S. aureus fueron remitidas al Dpto. de Microbiología del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud para la detección molecular de genes codificantes de enterotoxinas. Los aislamientos identificados como S. aureus por métodos fenotípicos fueron repicados en agar TSA (Agar Triptona Soja, Difco, Le Pont de Claix, Francia) e incubados a 35°C por 24-48 horas en presencia de 5% de CO2 para la extracción del material genético de las cepas.

La extracción del ADN genómico se realizó empleando kit comercial (Wizard Genomic, Promega, Madison, EEUU), siguiendo las instrucciones del fabricante para bacterias Gram positivas. La caracterización molecular de los aislamientos en estudio incluyó la detección de genes codificantes de factores de virulencia como las enterotoxinas A, B, C, D y H (sea 521pb, seb 667pb, sec 284pb, sed 385pb, seh 358pb), empleando oligonucleótidos y condiciones descritos previamente por Manfredi et al¹⁷ y Strommenger et al¹⁸.

Los ensayos moleculares mencionados fueron realizados en el tampón proveído (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, California, EEUU), a una concentración final de 0,03U/μL de Taq polimerasa (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, California, EEUU), 3mM de MgCl₂ (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, California, EEUU), 0,4 mM desoxirribonuclétidos trifosfato (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EEUU) y oligonucleótidos a una concentración final de 1μM (Macrogen Inc.,Seúl, Corea). La amplificación fue realizada en termocicladores Veriti (AppliedBiosystems, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 15 μL, con controles positivos y negativos. Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, utilizando un buffer TAE 1X (0,04M Tris-acetato - 0,001M EDTA) y el colorante intercalante de ADN SYBR® Safe DNA Gel Stain (Thermo Fischer Scientific, USA). La electroforesis se realizó con una fuente de poder constante a 100 V (Biorad, USA) durante 30 minutos. Luego, los amplicones se visualizaron con un transiluminador UV E3100 MyView (AccurisTM Instruments, USA) equipado con un adaptador SmartDocTM. Se utilizó un marcador de peso molecular de 50 pb a 1 kb (Jena Bioscience, Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania) fue utilizado para estimar el tamaño de los productos separados. Los resultados fueron registrados en formato de fotos digitales y analizados.

RESULTADOS

Se aisló S. aureus en el 30%⁶ de las muestras colectadas, 15%³ procedentes de un Mercado Municipal de Asunción y el otro 15%³ procedentes de Mercados de Gran Asunción, con recuentos entre 1x10² y 4x 10³ UFC/g.

En cuanto al cumplimiento de las buenas prácticas de manipulación, el 80%(16) de los locales no poseía agua potable, el 100%(20) de los manipuladores no realiza correcto lavado de manos antes y después de manipular el queso, el 100%(20) de los manipuladores recibe dinero y después manipula el queso sin lavarse las manos, el 65%(13) de los manipuladores no cuida su higiene personal: cabello corto, uñas cortas limpias, sin joyas; el 75%(15) no cuenta con equipos de refrigeración para la venta de queso; entre otras variables estudiadas.

La caracterización molecular de los aislados de S. aureus, permitió identificar la portación del gen codificante de la enterotoxina H (seH) en una muestra (17%, 1/6), como se observa en la Figura 2. No se detectaron los demás genes de enterotoxinas incluidos en el trabajo.

Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa al 2% de productos de PCR para detección del gen codificante de la enterotoxina H (seH 358 pb). Carriles: 1-Marcador de peso molecular de 50 pb Jena Bioscience, Alemania. 2- Control negativo de reacción. 3- Control positivo de reacción (seH, 358 pb). 4-Muestra negativa. 5- Muestra positiva (358 pb). 

DISCUSIÓN

La frecuencia de contaminación con S. aureus de los quesos artesanales analizados fue del 30%. Los resultados de este trabajo fueron menores a los reportados por otros autores de la región, como por ejemplo Tacuri y colaboradores. Se determinó la presencia de S. aureus en quesos frescos expendidos en un mercado público de la Ciudad de Cuenca en un 53,3% sin cumplimiento de las normativas, resultando un indicativo de déficit en la conservación, higiene y manipulación del producto¹⁹. Por otra parte, Gómez y colaboradores en el 2016, reportaron un 55% de incidencia de S. aureus en 30 muestras de diferentes tipos de quesos comercializados en 3 mercados de una ciudad ecuatoriana en el 2013. El queso artesanal presentó 100% de contaminación por S. aureus, el queso pasteurizado 61% y queso mozzarella 5%, demostrando que los quesos artesanales tienen mayor porcentaje de recuperación del microorganismo²⁰.

Mientras que, en una ciudad del Amazonas, Bustamante y colaboradores en el 2024, detectaron un alto nivel de portación (65%) de Staphylococcus spp en 40 diferentes muestras de quesos comercializados en los mercados de la ciudad: molido, fundido, parmesano, suizo y de cortes, demostrando que los quesos presentan una mala manipulación y condiciones higiénicas deficientes en la elaboración y en los lugares de venta, siendo un riesgo para la salud de la población²¹.

En este trabajo se logró identificar enterotoxina H de S. aureus en uno de los 6 aislados. Estos hallazgos coinciden con los presentados por Feijoó y col.²², en el que también aislaron S. aureus a partir de queso fresco expendido en mercados y centros comerciales de la ciudad de Cuenca (60 muestras de quesos, 40 de Mercados municipales y 20 de Comercios), de los que el 15,1% presentaron contaminación con S. aureus y 5 resultaron ser enterotoxigénicas, portadoras de genes codificantes de enterotoxinas estafilocócicas.

Mientras que autores como Gurgua Gutiérrez y colaboradores, detectaron valores superiores a los nuestros, en un 33% enterotoxina E, 67% toxina exfoliativa B y 50% toxina del síndrome del shock tóxico, en quesos frescos artesanales comercializados en un mercado público en Oaxaca, demostrando que los quesos de fabricación y comercialización artesanal son propicios a la presencia de S. aureus portadores de toxinas²³.

La identificación de los puntos de riesgo para la contaminación de productos alimenticios como el Queso Paraguay, puede ser considerado de utilidad debido a que se podría mejorar las condiciones sanitarias con medidas simples, tales como uso de guantes, disposición apropiada de la basura, acceso al agua potable para el lavado de manos frecuentes. Estas medidas de seguridad alimentaria son de bajo costo, fáciles de implementar y harían que este producto alimenticio que tiene alta demanda en el país pueda llegar al consumidor en condiciones más seguras.

La situación registrada coincide con las observaciones realizadas por Martínez-Vasallo y colaboradores, así como Bustamente y colaboradores^16,21, sobre las deficiencias en las condiciones sanitarias de producción y comercialización de este producto alimenticio artesanal.

Se ha detectado la contaminación con S. aureus 30% (6) de las muestras de Queso Paraguay artesanal comercializado en Mercados Municipales de Asunción y Gran Asunción con recuentos entre 1,0x10² y 4,0x10³ UFC/g. Una de las cepas de SAU fue portadora de la enterotoxina “H” 17% (1), capaz de producir intoxicación alimentaria. Hecho que señala la importancia del aseguramiento de medidas sanitarias en la elaboración y expendio para salvaguardar la salud de los consumidores; teniendo en cuenta además que el ser humano es uno de los principales reservorios de dicha bacteria. De aquí la importancia de la concienciación en el cumplimiento de las buenas prácticas de manipulación de alimentos.