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INTRODUCCIÓN
Chlamydia trachomatis (CT) es una bacteria gram negativa intracelular obligada, causante de la infección de transmisión sexual (ITS) bacteriana más prevalente en el mundo1,2. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), unas 357 millones de personas contraen anualmente alguna ITS incluyendo CT, gonorrea, sífilis o tricomoniasis1.
Es un patógeno humano que infecta células del epitelio cilíndrico monoestratificado ocular y de los tractos respiratorio, intestinal y genital. Las infecciones en mujeres suelen ser asintomáticas; en consecuencia, las infecciones no detectadas y no tratadas pueden progresar a otras condiciones tales como enfermedad inflamatoria pélvica, infertilidad, embarazo ectópico y dolor pélvico crónico3. En la mujer embarazada CT puede conducir a resultados obstétricos negativos como rotura prematura de membranas, prematuridad, bajo peso al nacer y mortalidad perinatal4. Las manifestaciones clínicas perinatales más comunes de la infección por CT adquirida en el recién nacido son la conjuntivitis de inclusión y la infección del tracto respiratorio inferior5.
El riesgo de adquirir esta infección es mayor en mujeres menores de 25 años6, y las adolescentes de entre 15 a 19 años de edad tienen las tasas más altas de infección7. En comparación con los adultos, los adolescentes tienen una mayor susceptibilidad biológica a CT y Neisseria gonorrhoeae8. Además, los factores de riesgo conductuales, como el número de parejas sexuales y el uso incorrecto e inconsistente del preservativo con las parejas masculinas, pueden predisponer a mayores tasas de infección. Las adolescentes embarazadas tienen un riesgo mayor que sus contrapartes no embarazadas porque existe menor probabilidad de uso de preservativo durante las relaciones sexuales, tanto en el momento de la concepción y a lo largo de su embarazo9,10.
La frecuencia de infección por CT en mujeres embarazadas ha sido reportada en diferentes países, en EE. UU se halló 7.4%11, 12,1 % en el Reino Unido12, 10.8% en Africa Subsahariana13, 9% en Brasil y 10% en Perú14,15. En Argentina existen escasos reportes en esta población, Kiguen et al. encontraron una frecuencia del 6.9%16.
Los centros para el control y prevención de enfermedades de los Estados Unidos (CDC) recomiendan hacer pruebas de detección de CT en la primera visita prenatal y repetir las pruebas en el tercer trimestre si la mujer es menor de 25 años o pertenece a un grupo de alto riesgo. Los países que han implementado estas recomendaciones disminuyeron la prevalencia de esta infección17.
Los métodos existentes para el diagnóstico de CT incluyen cultivos en líneas celulares, técnicas serológicas y técnicas moleculares. Si bien el gold- stándard sigue siendo el cultivo celular, metodologías como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) facilitan la identificación y diagnóstico aportando mayor especificidad y sensibilidad en la detección, aunque no es una técnica accesible para la mayoría de los laboratorios de análisis clínicos debido al elevado costo del equipamiento y a la experiencia necesaria en biología molecular, lo que conlleva al subdiagnóstico18.
En Argentina existen pocos datos sobre la frecuencia de infección por CT en mujeres embarazadas y la detección de este patógeno no se realiza de forma rutinaria en los programas de control del embarazo. La región del Noroeste de Argentina y la provincia de Jujuy no es ajena a la falta de datos epidemiológicos relacionados a esta infección, y más aún en mujeres embarazadas. Además, la disponibilidad de técnicas moleculares para su detección no es accesible para la gran mayoría de laboratorios de análisis clínicos.
Por lo expuesto anteriormente se propuso estudiar la epidemiología de esta ITS en mujeres embarazadas, teniendo en cuenta el impacto que genera tanto en la salud de la madre como en la del recién nacido, aplicando una técnica de biología molecular y evaluando también los factores de riesgo involucrados y estadíos vaginales básicos.
MATERIALES Y METODOS
Población
Este trabajo se realizó en forma prospectiva desde agosto a diciembre de 2022, en el Laboratorio de Bacteriología del Hospital Materno Infantil “Dr. Héctor Quintana” de San Salvador de Jujuy; siendo evaluado y aprobado previamente por el Comité de Ética de este hospital (Res. 437/24). Esta institución pública perteneciente al Ministerio de Salud de la Provincia de Jujuy, atiende a la población en general, la mayoría sin obra social y de característica socioeconómica muy heterogénea.
Se incluyeron 250 embarazadas, con edades entre 16 a 42 años, que concurrieron al consultorio de patología cervical a realizarse el estudio de PAP como parte del control de embarazo, previo a la toma de muestra las pacientes firmaron un consentimiento informado y respondieron un cuestionario. Se excluyeron aquellas pacientes con tratamiento antimicrobiano de 5 días previos, que hayan mantenido relaciones sexuales 48 hs. antes de la toma de muestra o las que presentaban hemorragia del tracto urogenital
Obtención de la muestra
Al mismo tiempo que se realizó el examen de cuello uterino con la utilización de espéculo y toma de muestra para PAP, se recolectaron tres hisopados:
Hisopado de cérvix uterino, utilizando hisopos de dacrón en buffer fosfato salino, para la detección de C. trachomatis por biología molecular.
Hisopado de las paredes y fondo de saco vaginal. Este hisopo se introdujo en un tubo conteniendo 0.5 ml de solución fisiológica estéril, el cual se destinó al examen en fresco para la evaluación de respuesta inflamatoria, la presencia de Trichomonas vaginalis y levaduras.
Hisopado de las paredes y fondo de saco vaginal, para realizar extendido para la coloración de GRAM.
Extracción de ADN
Para la extracción de ADN de las muestras se utilizó el kit comercial Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Alameda, CA, USA). El procedimiento se realizó siguiendo las indicaciones y recomendaciones del fabricante.
Detección de Chlamydia trachomatis
Se utilizó la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descripta por J.B. Mahony y cols. (19). Esta técnica se basa en la amplificación de un fragmento de ADN de 241 pb correspondiente a la posición 727 a 967 downstream del único sitio de restricción de la enzima BamH1 del plásmido críptico de C. trachomatis. Se usaron los cebadores KL1 y KL2 (Tabla 1). Como control positivo se utilizó plásmido críptico. En la Tabla 2 se muestran las condiciones de reacción y en la Tabla 3 la Master Mix.
PCR del gen de B- Actina
Se realizó en forma paralela una PCR para un fragmento de 587 pb del gen de la B-actina como control de inhibición y validación del ensayo (Tabla 2 y 3). El ensayo fue válido cuando los controles, tanto de la PCR del plásmido como de la B-actina, presentaron la reactividad esperada.
Electroforesis en gel de agarosa
Los productos de PCR se visualizaron por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer TAE, revelado con tinción Gel Red. Se utilizó un volumen de 5 ul del amplificado de cada muestra y el tiempo de corrida fué de 30 minutos a voltaje constante 100 V. La visualización se realizó bajo un transiluminador UV.
Diagnóstico de vulvovaginitis
A partir del hisopo de fondo de saco vaginal colocado en 0.5 ml de SF de procedió a la realización del examen en fresco, se homogenizo manualmente y se transfirió 2 a 3 gotas de la suspensión entre portaobjetos y cubreobjetos, las muestras se procesaron en un plazo no mayor a una hora luego de su obtención. Se observó al microscopio con un aumento de 400x para la investigación de presencia de levaduras, Trichomonas vaginalis y reacción inflamatoria. Con el hisopo colocado en tubo seco se realizó un extendido para coloración de GRAM. Con estos datos se determinó el Balance del Contenido vagina (BACOVA).
Análisis estadístico
Los registros de los pacientes fueron sistematizados, junto con la información colectada respecto a los factores de riesgo, para su análisis estadístico descriptivo y asociativo correspondiente. La caracterización inicial de la muestra se realizó a partir del cálculo de la proporción de casos y la misma en función de los diferentes factores de riesgo. Utilizando el programa Epi-Info v3.5.1 se realizó un análisis de regresión logística multivariante para la presencia de infección por Chlamydia trachomatis en función de los siguientes factores de riesgo: paciente menor de 25 años, nivel educativo, nueva pareja sexual en el último año, abortos previos, síntomas ginecológicos bajos e infecciones de transmisión sexual previas.
Tabla 1. Secuencia de primers utilizados para las regiones amplificadas de los genes del plásmido críptico de C. trachomatis y de B-actina.
| Secuencia de primers: C. trachomatis | |
|---|---|
| KL1 | 5´TCCGGAGCGAGTTACGAAGA 3´ |
| KL2 | 5´AATCAATGCCCGGGATTGGT 3´ |
| Secuencia de primers: B-actina | |
| B-actina (F) | 5´CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3´ |
| B-actina (R) | 5´AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC 3´ |
Tabla 2. Condiciones de ciclado para la reacción de PCR.
| Condiciones de ciclado para reacción de PCR | ||
|---|---|---|
| N° de ciclos | Temperatura | Tiempo |
| 1 | 94 | 5 min |
| 35 | 94 | 1 min |
| 55 | 1 min | |
| 72 | 30 seg | |
| 1 | 72 | 5 min |
| 1 | 14 | ∞ |
Tabla 3. Master Mix utilizadas para la detección de C. trachomatis y amplificación del gen de B-actina respectivamente.
| Master Mix PCR plásmido críptico Chlamydia trachomatis | ||||
|---|---|---|---|---|
| Reactivos | CC stock | CC reacción | X1 (ul) | X10 (ul) |
| H2O dd | 5.4 | 54 | ||
| Buffer 10x | 10X | 1x | 2.5 | 25 |
| Cl2Mg | 50 mM | 2 mM | 1 | 10 |
| dNTPs | 2.5 mM | 0.2 mM | 2 | 20 |
| KL1 | 10 uM | 0.8 uM | 2 | 20 |
| KL2 | 10 uM | 0.8 uM | 2 | 20 |
| Taq pol | 5 U | 0.5 U | 0.1 | 1.0 |
| DNA | - | 10 | - | |
| Master Mix B-actina | ||||
| Reactivos | CC stock | CC reacción | X1 (ul) | X10 (ul) |
| H2O dd | 6.75 | 67.5 | ||
| Buffer 10x | 10x | 1X | 2.5 | 25 |
| Cl2Mg | 50 mM | 4 mM | 2 | 20 |
| dNTPs | 2.5 mM | 0.25 mM | 2.5 | 25 |
| B-actin F | 20 uM | 0.4 uM | 0.5 | 5 |
| B-actin R | 20 uM | 0.4 uM | 0.5 | 5 |
| Taq. Pol | 5U | 1.25 | 0.25 | 2.5 |
| DNA | - | 10 | - | |
RESULTADOS
La frecuencia hallada de C. trachomatis fue de 7.6 % (19/250).
En la Tabla 4 se muestra la distribución de los resultados obtenidos según múltiples factores de riesgo.
Tabla 4. Factores de riesgo de infección por Chlamydia trachomatis.
| C. trachomatis + | C. trachomatis - | TOTAL | |
|---|---|---|---|
| Edad | |||
| < 25 años | 13 (17.3%) | 62 (82.7%) | 75 (30%) |
| >25 años | 6 (3.43 %) | 169 (96.57 %) | 175 (70%) |
| Nueva pareja sexual en el último año | |||
| SI | 2 (20%) | 8 (80%) | 10 (4%) |
| NO | 17 (7.08%) | 223 (92.92%) | 240 (96%) |
| Abortos Previos | |||
| SI | 6 (26.09%) | 17 (73.91%) | 23 (9.2%) |
| NO | 13 (5.73%) | 214 (94.27%) | 227 (90.8%) |
| Síntomas Ginecológicos Bajos | |||
| SI | 12 (22.64%) | 41 (77.36%) | 53 (21.2%) |
| NO | 7 (3.55%) | 190 (96.45%) | 197 (78.8%) |
| ITS previas | |||
| SI | 3 (15.79%) | 16 (84.21%) | 19 (7.6%) |
| NO | 16 (6.93%) | 212 (93.07%) | 231 (92.4%) |
Tabla 5. Análisis de Regresión Logística Multivariante para la presencia de infección Chlamydia trachomatis en función de múltiples factores de riesgo.
| Variables independientes | Beta de regresión | p-valor |
|---|---|---|
| Menos de 25 años | 3,8961 | 0,000537 |
| Nueva pareja sexual en el último año | 2,2131 | 0,060471 |
| Abortos previos | 3,7293 | 0,001852 |
| Síntomas ginecológicos bajos | 2,1782 | 0,000508 |
| ITS previas | 1,8439 | 0,004078 |
Referencia: *) p-valor <0,05) p-valor ≥ 0,05
Tabla 6. Estadios vaginales básicos e infección por Chlamydia trachomatis. MN: Microbiota Normal. RIV: Reacción Inflamatoria Vaginal, MI: Microbiota Intermedia. VB: Vaginosis Bacteriana. VMI: Vaginitis Microbiana Inespecífica. EVB.
| EBV | C. trachomatis + | C. trachomatis - | TOTAL | OR (IC 95%) |
|---|---|---|---|---|
| I (MN) | 3 (15.8%) | 124 (84.2%) | 127 | 0.162 (0.046-0.570)* |
| II (MN + RIV) | 10 (52.6%) | 60 (47.4%) | 70 | 3,17 (1,228 - 8,167)* |
| III (MI) | 0 (0%) | 7 (100%) | 7 | 0,77 (0,042 - 13,948) |
| IV (VB) | 0 (0%) | 20 (100%) | 20 | 0,26 (0,015 - 4,544) |
| V (VMI) | 6 (31.6%) | 20 (68.4%) | 26 | 4,87 (1,669 - 14,203)* |
| TOTAL | 19 (7.6%) | 231 (92.4%) | 250 | ----------- |
Referencia: *) OR = Odds Ratio, IC = Intervalo de Confianza, * = p-valor < 0,05
DISCUSIÓN
En el mundo la incidencia de este patógeno en mujeres embarazadas varía entre 0.1% y 25.7% dependiendo de las características de la población estudiada y los métodos utilizados20,21. Si bien los diseños de los estudios varían y las comparaciones podrían ser complejas, nuestros hallazgos son similares a los publicados en Sudamérica14,15,22. Además, coincide con reportes en Argentina, como el de Kiguen y col. y Marramá que encontraron frecuencias de 6.9% y 10.4% respectivamente16,23. A la fecha, no se encuentra en la literatura disponible estudios de prevalencia de este patógeno en la provincia de Jujuy.
El análisis de regresión logística multivariante para la presencia de infección por Chlamydia trachomatis indica que, a excepción de la variable “nueva pareja sexual en el último año”, las restantes constituyen factores de riesgo. Esto significa que la presencia de los mismos aumenta las chances de detección del patógeno en el paciente (Tabla 5).
Con respecto a la edad, la prevalencia hallada fue mayor en mujeres menores a 25 años, obteniéndose una diferencia significativa. Kiguen y col. encontraron altos porcentajes de positividad en embarazadas de 21 a 25 años16, esto se puede explicar por la diferencia anatómica en la unión escamocolumnar del cérvix que está evertida y expuesta favoreciendo la infección24.
La presencia de ITS facilita y aumenta el riesgo de infección por C. trachomatis, ya que las alteraciones en el epitelio escamocolumnar propician la entrada de los cuerpos elementales y el establecimiento de la infección25. En el presente trabajo la frecuencia de CT fue sigificativamente mayor en pacientes con ITS previas, lo que concuerda con resultados obtenidos por G y col. (26), que reportaron una mayor prevalencia en mujeres con gonorrea o tricomoniasis previa.
La infección por C. trachomatis presenta manifestaciones clínicas inespecíficas y muchas pacientes no presentan síntomas (22). En este estudio el 22.64% de las pacientes con síntomas ginecológicos bajos presentó infección por CT, con una asociación significativa, en coincidencia con Zucotti y col.27.
Gutiérrez-Campos y col.28, reportaron la asociación entre el aborto y la infección por Chlamydia. La invasión del espacio coriodecidual por esta bacteria, lo cual ocasiona inflamación placentaria y corioamnionitis, sería el mecanismo por el cual puede generar pérdida gestacional. La corioamnionitis favorece la liberación de proteasas, las cuales llevan a ruptura prematura de membranas, activación de la cascada del ácido araquidónico, contracción uterina y finalmente a parto prematuro o abort (29. En el presente estudio se encontró mayor frecuencia de Chlamydia en las pacientes que presentaron abortos previos.
Por otra parte, el 20% de las embarazadas infectadas refirieron haber tenido una nueva pareja sexual en el último año, aunque no se encontró una asociación significativa con este supuesto cofactor. Sin embargo, Fischer y cols. reportaron que un mayor número de parejas sexuales o haber tenido una pareja ocasional en los últimos doce meses se relaciona a un mayor riesgo relativo de infección por Chlamydia30.
Finalmente, el análisis de asociación entre la presencia de infección por Chlamydia trachomatis y los diferentes niveles del estadío vaginal básico indica presencia significativamente aumentada de casos positivos en EVBII y EVBV(Tabla 6). Estos resultados concuerdan parcialmente con un estudio realizado por Jordá (2014) en nuestro país donde se observó C. trachomatis en todos los EVB pero significativamente en el EVB V31.
Concluyendo, se aportaron los primeros datos epidemiológicos locales y en una población particularmente vulnerable y de alto riesgo para esta infección. Si bien, debido a las complicaciones de la enfermedad y los riesgos asociados con la infección, el CDC recomienda que todas las mujeres sexualmente activas menores de 25 años de edad reciban anualmente un cribado para la detección de Chlamydia, Argentina no tiene consenso para el cribado durante el embarazo, por lo que es de suma importancia realizar el diagnóstico oportuno con métodos de elevada sensibilidad como la PCR, favoreciendo tratamientos tempranos, para reducir el riesgo de diseminación del agente y evitar complicaciones más graves considerando el impacto directo que tiene en la salud materno- infantil.
