Evaluación del contenido de esteviósido y rebaudiósido A en una población de Stevia rebaudiana Bertoni (kaâ heê) cultivada comercialmente. Estudio preliminar
Evaluation of the content of stevioside and rebaudioside A in a population of Stevia rebaudiana Bertoni (kaâ heê) commercially cultivated. A preliminary study
*Jiménez TI, Cabrera GII, Álvarez EII, Gómez FII
IInstituto Nacional de Tecnología y Normalización (INTN). Asunción-Paraguay
IIInstituto Agronómico Nacional (IAN). Caacupé Paraguay
RESUMEN
Stevia rebaudiana Bertoni (kaâ heê) es un arbusto originario de la Región Oriental de Paraguay. Sus hojas contienen glucósidos diterpénicos que producen un sabor dulce, pero sin valor calórico y son de 150 a 300 veces más dulces que la sacarosa (solución al 0,4%). Durante las temporadas agrícolas 1998 y 1999 se establecieron sembrados de selección individual, en el Instituto Agronómico Nacional (Caacupé, Paraguay).El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de esteviósido y rebaudiósido A en plantas seleccionadas en campo a fin de evaluar la variabilidad existente en la población e identificar clones con alto contenido de dichos glucósidos. De una población original de 2000 individuos, se seleccionaron fenotípicamente 140 plantas por características agronómicas superiores y se cosecharon en etapa de prefloración y libres de polinización. En los Laboratorios del Instituto Nacional de Tecnología Normalización y Metrología (INTN) fueron evaluados los contenidos de esteviósido y rebaudiósido A por detección por cromatografía liquida de alta resolución. El contenido de esteviósido fluctuó entre 0 y 21 % concentrándose el 92 % de la población entre valores del 5 al 15 % .En cuanto al contenido de rebaudiósido A se obtuvieron valores entre 0 y 12 % correspondiendo al 68 % de la población un contenido entre 3 y 9 %. La demanda actual de stevia se halla en creciente aumento, por lo que las acciones orientadas a establecer líneas clonales con alto contenido de principios edulcorantes permitirá a los productores primarios la obtención de cultivos más productivos e incrementara el rendimiento de obtención de glucósidos.
Palabras clave:Esteviósido, rebaudiósido A, líneas clonales, Stevia rebaudiana.
ABSTRACT
Stevia rebaudiana Bertoni (kaâ heê) is a bush native to the Eastern Region of Paraguay. Its leaves contain diterpene glycosides that produce a sweet taste but without any caloric value and are 150 to 300 times sweeter than sacharose (0, 4% solution). During 1998 and 1999 agricultural seasons, individual selection sown fields were established in the National Agronomical Institute (Caacupé, Paraguay). The objective of this work was to determine the content of stevioside and rebaudioside A in these selected plants in the field in order to evaluate the variability existent in the population and identify clones with high content of those glycosides. Of an original population of 2,000 specimens, 140 plants were selected phenotipically by the superior agronomical characteristics and they were harvested in the period of pre-flowering and were pollination free. The content of stevioside and rebaudioside A were evaluated in the laboratories of the National Institute of Technology, Standardization and Metrology (INTN in Spanish) by high resolution liquid chromatography. The content of stevioside ranged from 0 to 21% concentrating the 92% of the population between 5 to 15%. In relation to rebaudioside A, values between 0 and 12% were obtained being 68% of the population between a content of 3 to 9%. As the current demand of Stevia is increasingly rising, the actions oriented to establish clonal lines with high content of sweetener principles will allow primary producers to obtain more productive cultivations and increase the output of glycoside obtainment.
Keywords:Stevioside, rebaudioside A, clonal lines, Stevia rebaudiana.
]]> INTRODUCCION
Las personas que, por diversas razones, deben reemplazar a la sacarosa debido a su alto contenido calórico buscan edulcorantes no calóricos con gusto y características similares a la misma (1).Varias sustancias han sido propuestas para tal efecto, pero pocas han probado ser seguras para el consumo humano, con poder edulcorante y satisfactoriamente estables. Sacarina, ciclamato, aspartame, sucralosa (edulcorante no calórico derivado del azúcar común) y los extractos de hojas de Stevia rebaudiana, entre otros, son permitidos por legislaciones de países de la región (2,3). Los glucósidos de esteviol son alternativas naturales para los edulcorantes sintéticos y para pacientes con enfermedades relativas al metabolismo del azúcar. Son muy usados en las industrias alimentarias en Japón, Corea y Brasil (4). En los EE.UU. la Agencia de Alimentos y Drogas (FDA), aprobó en septiembre de 1995, a los glucósidos de esteviol como edulcorantes naturales no calóricos (1). El establecimiento de reglas para el uso de esteviosidos y hojas de Stevia rebaudiana en los EEUU está ahora en progreso (5). En nuestro país existen normativas para el uso de productos derivados de la Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertonicomo aditivo alimentario con función edulcorante así como medicamentos especiales que provienen de esta planta (fitoterapéuticos) (6) El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA)en sus reuniones 68ª y 69ª del año 2008, estableció una Ingestión Diaria Admisible (IDA) para los glucósidos de esteviol de 0-4 mg por kg de peso corporal por día, expresada como esteviol. (7) Los glucósidos de esteviol son una mezcla de componentes de diferentes pesos moleculares. Dado que el componente activo efectivo es la parte de esteviol de las distintas moléculas, la IDA se refiere al peso molecular del total de esteviol presente en la mezcla (8).
Stevia rebaudiana Bertoni (Kaâ Heê es un arbusto de la familia de las compositae (asteraceae) y uno de los 154 miembros del genero Stevia. Originario de la Región Oriental de Paraguay, sus hojas contienen glucósidos específicos que producen un sabor dulce pero no tienen valor calórico y son cerca de 150 a 300 veces más dulces que la sacarosa (9) Contienen de 45 a 50% de material soluble en agua. Por siglos esta hierba edulcorante ha sido usada por nativos Guaraníes para contrarrestar el sabor amargo de varias medicinas y bebidas a base de plantas. Muchos países demostraron interés en el cultivo y comercialización de nuestra “hierba dulce” nativa y a nivel nacional se ha dado comienzo a la Investigación en este campo.(10,11) Las hojas contienen una compleja mezcla de glucósidos naturales diterpénicos dulces (steviol-glicósidos o glucósidos de steviol): esteviósido (4-13%), esteviolbiosido (trazas), rebaudiósido A (2-4%), rebaudiósido B (trazas), rebaudiósido C (1-2%), rebaudiósido D (trazas), rebaudiósido E (trazas) y dulcosido A (0,4-0,7%)(8,9). El mayor contenido de esteviósido se encuentra en las hojas, lo que sugiere que estas sirven como el tejido principal para la síntesis y acumulación primaria de glucósidos de esteviol (12,13).
Aun definiendo cantidades diarias de ingesta aceptables sus características sensoriales pueden variar de acuerdo al producto en que se encuentran y la temperatura de consumo (14). En cuanto a la fotoestabilidad no se reporta una fotodegradación significativa, tanto para el esteviósido como para el rebaudiósido A (15).
Entre los glucósidos diterpénicos de la stevia, el esteviósido es el componente principal, constituyendo cerca del 85% de los edulcorantes totales, y rebaudiosido A, en menor proporción es el componente más dulce. Estos dos componentes han sido empleados por el altísimo poder edulcorante y la baja toxicidad. Al esteviósido se le ha atribuido, además, un poder antihipertensivo según estudios en animales y humanos (16) y es usado en el tratamiento de la diabetes (4) Actualmente en el Paraguay, la mayor parte se comercializa como hoja seca, y su procesamiento se limita a la elaboración de saquitos de té y /o extractos acuosos y comprimidos. Existen actualmente en nuestro país empresas procesadoras de las hojas, obteniendo extractos en polvo de glucósidos de steviol de 85% a 95% de pureza.
En enero de 1999 se firmó un convenio entre el Instituto Agronómico Nacional (IAN) sito en Caacupé (Paraguay) y el Instituto Nacional de Tecnología, Normalización y Metrología sito en Asunción (Paraguay) para investigación del kaâ heê. Durante las temporadas agrícolas 1998 y 1999 se establecieron parcelas de selección Individual, en cultivos realizados en el IAN con el objeto de clasificar líneas clonales con alto potencial productivo de hojas secas a nivel de campo, buenas características agronómicas, tolerancia y/o resistencia a enfermedades y alto contenido de esteviósido y rebaudiósido A. Existen reportes de que el rendimiento de la cosecha de la stevia sin cultivos intercalados es mayor que cultivándola junto a otras especies como la cebada (Hordeum vulgare) (17). El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de esteviósido y rebaudiósido A en plantas seleccionadas en campo por características agronómicas superiores, a los efectos de evaluar la variabilidad existente en la población e identificar clones con alto contenido de dichos glucósidos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño: Descriptivo, de corte transversal.
Materiales: De una población original de 2000 individuos, plantación cultivada comercialmente por los agricultores, se seleccionaron fenotípicamente por características agronómicas superiores plantas cosechadas en etapa de prefloración y libres de polinización. Se ha descrito anteriormente que el momento ideal de corte se da cuando la planta empieza a emitir botones florales o una semana antes que aparezcan flores abiertas. En esta etapa la cantidad de glucósidos de esteviol en hojas es mayor que en otras etapas de cosecha (10,18). En la campaña del año 1998 fueron seleccionados 44 individuos (plantitas) y durante el año 1999; 96 individuos, totalizando 140 individuos que representan un 7% de la población total de 2000 individuos.
]]> Método: Las hojas frescas de las 140 muestras fueron secadas a temperatura ambiente entre 25°C y 30°C y luego molidas en molino eléctrico hasta obtener un polvo fino. (19) Un gramo de cada muestra fue disuelto en 100 ml de agua. Esta solución se mantuvo a 80°C, durante 45 minutos con agitación periódica. Una vez filtradas las muestras se procedió al lavado con acetonitrilo al 20%. El producto lavado fue colectado en tubos de ensayo e inmediatamente se realizo la elución con acetonitrilo al 80%. La muestra fue filtrada con una membrana de 0,45 µm de teflón PTFE (Millex-LCR Millipore) y colocadas en ampollas para ser inyectadas al equipo.La metodología analítica empleada es la sugerida por Hashimoto y Morigasu (20) cuyo fundamento es que los componentes glucosídicos, previa extracción acuosa se separan de acuerdo a su peso molecular a través de una columna amínica (20,21). Se empleó un equipo de cromatografía liquida de alta resolución (Shimadzu Japón) equipado con inyección manual, compresor de aire y un detector UV/Vis. A una longitud de onda de 210 nm se inyectaron 10 µl de disoluciones de patrones y muestras y se utilizó una columna Chemcosorb 5NH2-U de 4,6 mm x 150 mm (Chemco, Japón) a temperatura de 25°C .Fue utilizada una fase móvil de acetonitrilo y agua en proporción 80:20. Se aplicó un flujo de 1 mL/min. Las muestras analizadas se compararon con estándares internos de valor conocido de esteviósido de 99,6% y rebaudiósido A, pureza de 98,2% (Wako Chemicals, Japon) Los resultados se expresan en % de esteviósido y/o rebaudiósido A.
RESULTADOS
El promedio de contenido de esteviósido en las muestras analizadas (n:140) fue de 9,14% hallándose un mínimo de 3,74% y un máximo de 20,57%,y el promedio de contenido de rebaudiósido A fue de 4,63% obteniéndose un contenido mínimo de 0,04% y máximo mayor a 12,1%.
En los individuos analizados el 61,4% de las muestras (86 individuos) presentó contenidos de esteviósido que fluctúan entre 5,1 y 10% y el 32% (44 individuos)presentó contenidos que fluctúan entre 10,1 y 21%, identificándose uno con 20,57% de esteviósido que servirá para constituir una línea clonal con nivel elevado de la sustancia edulcorante.(Ver figura 1)
En cuanto al contenido de Rebaudiósido A, la concentración varía entre 0 y 12% concentrándose el 68% entre los valores de 3,1 a 9,0% (95 individuos). (Ver figura 2 y tabla 1).
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Cabe destacar que el individuo que contiene un elevado contenido de steviosido no necesariamente presenta un elevado contenido de rebaudiósido A. Los individuos que presentan 5,1% a 10% de esteviol-glucósidos tienen una cantidad importante de ambos edulcorantes (ver Figura 3). El análisis de resultados presentados muestran que existe una gran variabilidad para los contenidos de esteviósido y rebaudiósido A, ya que lastevia se reproduce sexualmente por fecundación cruzada (alogama) por lo que no debe extrañar la diversidad fenotípica y genotípica que se observa en plantas que crecen espontáneamente, así como en cultivos comerciales (22,23).
Los resultados indican que ambas características son gobernadas por genes de herencia cuantitativa por lo que es de esperar influencias de factores ambientales sobre los mismos (época de cosecha, pos cosecha, temperatura, humedad, fotoperiodo -tiempo en que los organismos están sometidos a la acción de la luz entre dos períodos de oscuridad- (10,24)
DISCUSION
]]> El análisis de los resultados presentados muestra que existe una gran variabilidad para los contenidos de esteviósido y rebaudiósido A (23) observándose valores de 0 -21% para esteviósido, y 0 a 12% para rebaudiósido A, contenidos en las hojas similares a los resultados obtenidos por otros autores (17,23). Fue posible identificar individuos cuyo contenido de esteviósido alcanza valores de 21% y de rebaudiósido A con valores de 12% constituyéndose en material de partida idóneo para la obtención de líneas clonales con elevado contenido de estos glucósidos.La demanda actual de stevia se halla en creciente aumento, por lo que las acciones orientadas a establecer líneas clonales con alto contenido de principios edulcorantes permitirá a los productores primarios la obtención de un cultivo de mayor rendimiento e incrementara el rendimiento de cristalización (19,24).
Se necesitan más estudios acerca de los componentes e impurezas del producto cristalizado con el objeto de obtener un producto nacional que pueda competir en mercados exigentes (9,11).
Agradecimientos:A la Dra. Verónica Villagra, Asesora de Dirección General, Instituto Nacional de Tecnología, Normalización y Metrología por el tiempo dedicado a la lectura y revisión de este manuscrito, y que lo haya enriquecido con sus aportaciones.
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*Autor Correspondiente: Ing. Qca. Trini Jiménez,Directora del Organismo de Investigación y Asistencia Tecnológica del Instituto Nacional de Tecnología, Normalización y Metrología. Avda Artigas 3973 y Gral. Roa Asunción-Paraguay.
Email: trini_vj@hotmail.com. Fecha de recepción:Febrero de 2010, Fecha de aceptación: mayo de 2010
