CORRELACIÓN DE LOS CAMBIOS MORFOMÉTRICOS EN RIÑÓN Y MÉDULA ÓSEA EN CANINOS INFECTADOS NATURALMENTE CON Leishmania sp.

CORRELATION OF THE MORPHOMETRIC CHANGES IN KIDNEY AND BONE MARROW IN DOGS NATURALLY INFECTED WITH Leishmania sp.

*Paola S¹, Avalos A¹, Maidana L¹, Suarez M¹, Marecos E¹, Oreggioni G²

¹ Universidad Nacional de Asunción - Facultad de Ciencias Veterinarias - Departamento de Ciencias Patológicas - San Lorenzo - Paraguay

² Tesista de Grado para optar al título de Doctor en Ciencias Veterinarias - Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Asunción

RESUMEN. La glomerulonefritis de tipo mesangioproliferativa y/o membranoproliferativa; así como los cambios en médula ósea que contribuye al desarrollo de anemia severa asociada a trombocitopenia, es comúnmente observada en animales con leishmaniasis visceral canina (LVC). El objetivo fue determinar la relación de los cambios morfométricos macro y microscópicos del riñón y médula ósea (MO) con el número de amastigotes de Leishmania sp/mm² en MO. Se evaluaron 47 canes de diferentes edades y sexos, infectados naturalmente con Leishmania sp; que fueron agrupados según el número de Leishmania sp/mm² en MO como: carga baja, moderadamente baja, moderadamente alta y alta. Los parámetros morfométricos macroscópicos medidos en riñón fueron: longitud del riñón; anchura de riñón y espesor del riñón; los microscópicos: número de glomérulos renales/mm²; diámetro de glomérulos renales en corteza; espesor de la cápsula Bowman del riñón y porcentaje de tejido conjuntivo en riñón y en médula ósea: el porcentaje de tejido hematopoyético y estroma. Se observó una significativa diferencia entre los grupos según el número de amastigotes de Leishmania sp en MO/mm² (p=0.0002). No se observo relación entre los parámetros morfométricos macro y microscópicos del riñón y MO con la carga parasitaria (R² = 0.06). Estos resultados indican una amplia magnitud de lesiones macro y microscópicas en riñón y MO en perros con LVC independiente del número de Leishmania sp/mm² en MO.

Palabras clave: Leishmaniasis visceral canina, cambios morfométricos, riñón, médula ósea, carga parasitaria, Leishmania sp, caninos

ABSTRACT. Mesangioproliferative or membranoproliferativa glomerulonephritis; as the changes in bone marrow, which contributes to the development of severe anemia associated with thrombocytopenia are observed in animals with leishmaniasis canine visceral (LCV). The aim was to determine the relation between morphometric macroscopic and microscopic changes of kidney and bone marrow (BM) with the number of amastigotes of Leishmania sp in BM. Forty-seven dogs of different ages and sexes, naturally infected with Leishmania sp were evaluated and grouped according to the number of Leishmania sp/mm² in BM: low load, moderately low load, moderately high load and high load. Macroscopic morphometric parameters were measured in kidney: length, width and thickness; microscopic parametrec: number of glomeruli in kidney/mm², diameter of glomeruli in cortex, Bowman capsule thickness and percentage of stroma; and in bone marrow: the percentage of hematopoietic tissue and stroma. A significant difference was observed between the groups according to the number of amastigotes of Leishmania sp/mm² BM (p=0.0002). No relationship between the macro and microscopic morphometric parameters kidney and BM with parasite load (R²=0.06). These results suggest a wide magnitude of macro and microscopic lesions in kidney and BM in dogs with LVC are an independent of the number of Leishmania sp/mm² BM.

Keywords: Canine Leishmaniasis, morphometry changes, kidney, bone marrow, parasite load, Leishmania sp, dog

La Leishmaniasis visceral canina (LVC) es considerada una zoonosis importante con una patogenia compleja, transmitida por un vector biológico del género Lustzomia (América) y Phlebotomus (Viejo Mundo) (1). Está ampliamente distribuida en todos los continentes a excepción de Oceanía. En América del Sur, la prevalencia de Leishmania sp en los perros puede variar ampliamente, reportándose cifras desde 25% hasta de 75% (2). En Paraguay, el 45% de los canes son serológicamente positivos y son considerados como principal reservorio de la enfermedad (3).

El resultado de la infestación varía dependiendo del vector, el parásito y el huésped (4,5). En pacientes susceptibles a la enfermedad, el agotamiento de los linfocitos T en los órganos linfoides, se compensa con proliferación excesiva de linfocitos B, posteriormente activadas a células plasmáticas, así como proliferación de histiocitos y macrófagos. Este fenómeno puede explicar la linfoadenomegalia, esplenomegalia e hiperglobulinemia policlonal consideradas características clínicas típicas en canes con LVC (5). Por otra parte la hiperglobulinemia no es protectora, sino perjudicial, con una acción directa o indirecta con generación de auto-anticuerpos, anticuerpos anti-histona, y/o complejos inmunes circulantes generados en cantidades considerables que serán depositados en diversos tejidos y órganos (6,7). Las principales alteraciones orgánicas observadas en LVC son patologías dérmicas, renales, oculares y sanguíneas.

En ocasiones la enfermedad renal es la única alteración clínica observada y la principal causa de muerte en canes con este padecimiento (8). Los estudios histopatológicos de los riñones de pacientes con LVC casi siempre revelan glomerulonefritis, tipo mesangioproliferativas y/o membranoproliferativas y nefritis tubulointersticial; mientras que la amiloidosis es rara de observar. (9,10). Las lesiones túbulos intersticiales son secundarias a la lesión glomerular, inflamación mediada por complejos inmunes y fibrosis renal. (11). Mientras que el depósito de inmuno-complejo es el principal mecanismo para la inducción de la glomerulonefritis, la inflamación granulomatosa caracterizada por una infiltración y proliferación de macrófagos, histiocitos, linfocitos y células plasmáticas, es la principal responsable de las alteraciones histológicas observadas en otros órganos como ser linfonódulos, bazo, hígado, intestinos y médula ósea (MO) (5). En la MO, el número de amastigotes suele ser alto y la inflamación granulomatosa va asociada a la hiperplasia eritroidea linfoplasmocítica, una hipoplasia y/o displasia megacariocítica, un aumento de la relación mieloide/eritroide y eritrofagocitosis, que en conjunto contribuyen al desarrollo de una anemia severa con frecuencia asociada a trombocitopenia (12). Además, el establecimiento de la anemia en pacientes con leishmaniasis canina se ve favorecida por el daño renal, considerando que el riñón es el sitio principal de producción de la hormona eritropoyetina, la cual es responsable de la formación de eritocitos.

Todos los estudios referenciados describen los cambios microscópicos renales y en MO de animales que padecen leishmaniasis canina; dichas evaluaciones están enfocadas a observaciones descriptivas e independientes; sin la asociación entre ambos órganos y/o correlación de las alteraciones con la cantidad de parásitos; por lo que el presente estudio tiene como objetivo general determinar la relación de los cambios morfométricos macro y microscópicos del riñón y médula ósea con el número de amastigotes de Leishmania sp en MO en canes infectados naturalmente con Leishmaniasis visceral canina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y muestras

Fueron analizadas un total de 47 muestras de riñón y 47 muestras de médula ósea obtenidos de canes serológica y citológicamente positivos a LVC, sin distinción de edad, raza y sexo, procedentes del Hospital Veterinario "Prof. Dr. José Vicente Núñez", del Programa Nacional de Zoonosis y Centro Antirrábico Nacional (CAN) y clínicas veterinarias privadas del Departamento Central-Paraguay. Dichos animales fueron eutanasiados humanitariamente con una sobredosis de tiopental sódico (BIOSANO S.A.) vía endovenosa (250 mg/kg) y sometidos a necropsia en el Departamento de Ciencias Patológicas de la Facultad de Ciencias Veterinarias-UNA, previa autorización firmada por los propietarios. A la necropsia, los animales fueron pesados y se obtuvieron frotis de medula ósea, que se fijaron con metanol p.a. (Biopack, Argentina), luego se realizó la evaluación de los parámetros macroscópicos y finalmente se obtuvieron fragmentos de ambos riñones que incluyeron corteza y médula renal; además, medula ósea procedente de estérnebra que fueron fijadas en solución bufferada de formaldehido al 10% (Lasca, Paraguay).

Morfometría macroscópica renal. Parámetros:

1. Peso del animal y riñones, en gramos ]]> 2. Longitud, anchura y espesor de riñones, cm
3. Longitud de médula y corteza, al corte transversal en cm

Citología e histopatología

Los frotis de médula ósea fueron teñidos con una solución bufferada de Giemsa al 5% (Biopack, Argentina) durante 30 min y lavados con agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante. Los fragmentos de tejido renal y médula ósea fueron procesados mediante la técnica histológica de rutina, cortados a 4 micras y teñidos con hematoxilina y eosina (H&E). El tricromico de Masson (Biopack, Argentina) se utilizó para la identificación de tejido conjuntivo denso en el intersticio renal.

Para la cuantificación citológica de la carga parasitaria en médula ósea y formación de grupos de estudio, el número de amastigotes de Leishmania sp independiente a su localización intra y/o extracelular en las muestras citológicas de MO fueron valoradas en 40 campos consecutivos no superpuestos con objetivo de 0,2 mm². La conformación de los grupos se realizo mediante la utilización de los estadísticos: mediana, mínima, máxima y cuartiles 1 y 3. Tabla 1.

Morfometría microscópica renal

La medición microscópica de los riñones se realizó en 25 campos consecutivos no superpuestos de 0,05 mm2 evaluados mediante la utilización del software de imagen, Imagen J (Version 1.49 23 June 2015. The Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA).

Parámetros:

1. Espesor de la capsula de Bowman, en µm. ]]> 2. Número de glomérulos y diámetros, en número ordinales y µm respectivamente.
3. Estroma intersticial renal con tinción tricromico de Masson, en porcentaje de área.

Morfometría microscópica de la MO

Se realizaron en campos de 0,02 mm² consecutivos no superpuestos, valorados con el software de imagen Imagen J (Versión 1.49 23 June 2015. The Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA).

Parámetros:

1. Tejido hematopoyético, en µm² .
2. Tejido de sostén, en porcentaje.

Valoración de los resultados

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Cuantificación citológica de la carga parasitaria en médula ósea

Con relación al número de amastigotes de Leishmania sp. independiente a su localización intra y/o extracelular en MO/mm², los caninos infectados se agruparon en 4 categorías. Figura 1 y Tabla 1. Los categorizados como de baja carga, se constituyeron por siete caninos. Clínicamente uno fue considerado asintomático y seis oligosintomáticos. El segundo grupo, con carga moderadamente baja representado por 13 caninos; uno asintomático, diez oligosintomáticos y dos sintomáticos. El tercer grupo categorizado como moderadamente-alta fueron 13 canes, uno asintomático, once oligosintomaticos y uno sintomático y el grupo con alta carga con 13 caninos, dos asintomáticos, ocho oligosintomáticos y tres sintomáticos.

La virulencia del parasito y la respuesta inmunológica del hospedador son los que determinan la presencia o la ausencia de signos clínicos existiendo así portadores asintomáticos y sintomáticos (14,15). Aunque exista una buena correlación entre la intensidad de la reacción inflamatoria, la carga parasitaria y el estatus clínico de la enfermedad (16); en este estudio se observó una amplia variabilidad de síntomas, sin que las misma se correlacionen con la carga parasitaria.

Morfometría macroscópica renal

El peso del tejido renal con relación al peso corporal y la relación corteza/médula en las diversas categorías en estudio: carga baja, moderadamente-baja, moderadamente-alta y alta; así como los parámetros morfométricos macro y microscópicos evaluados en dicho órgano, según las categorías en estudio, no son estadísticamente significativas cuando se comparan entre si. Aunque, los animales categorizados como de alta carga parasitaria en MO presentaron las menores medianas de los parámetros macroscópicos. Figura 2 y Gráfico 1.

Morfometría microscópica renal y de médula ósea

Con relación a los valores microscópicos correspondientes a los caninos del grupo de alta carga, presentaron menor número de glomérulos por mm² en corteza renal, con aumento del diámetro de los mismos, del espesor de la Cápsula de Bowman, y del porcentaje de tejido conjuntivo renal. Los resultados demostraron que, cuando menor fue el número de glomérulos por mm² en corteza renal, mayor fue el diámetro de los mismos, atribuible a un fenómeno de adaptación/compensación fisiológica del órgano para el proceso de función glomerular del plasma sanguíneo Figura 3.

Si bien, no existe diferencia estadística significativa entre los porcentajes de mediciones morfométricas en MO entre las categorías: carga baja, moderadamente-baja, moderadamente-alta y alta; las medianas de la categoría de alta carga parasitaria presentó el menor porcentaje de tejido hematopoyético en MO. Gráfico 2.

Estos hallazgos no se registran de manera constante entre sí, al evaluar en todas las categorías en estudio, quizás sea debido a una respuesta inmune Th1 / Th2 mixta, la cual da lugar a daños tisulares a través de diferentes mecanismos patológicos, como ser: reacciones inflamatorias granulomatosa, deposición de inmunes complejos, y/o la producción de autoanticuerpos. Este es un mecanismo de compensación, aunque perjudicial generado principalmente por la incapacidad de los macrófagos para eliminar al parásito en animales susceptible. (6)

Cuando se relaciona la carga parasitaria con los parámetros morfométricos del riñón y médula ósea en todos los animales en estudio no se observó relación. Tabla 2 y 3.

* Cuando aumenta el número de Leishmania sp en MO/mm² disminuye la longitud de los riñones. Este fenómeno se distinguió claramente en los animales que conforman el grupo de baja y alta carga parasitaria.

* Cuando aumentó el número de Leishmania sp MO/mm² en los animales en estudio, aumentó el diámetro de los glomérulos renales, con una disminución del número por mm². Además se observó un aumento del porcentaje de tejido conjuntivo renal y el espesor de la capsula de Bowman. Si se relacionan los parámetros del grupo de baja carga se observa una tendencia más pronunciada al aumento del espesor de la capsula de Bowman, acompañado de una disminución del diámetro de los glomérulos.

* Mientras que en el grupo de moderadamente-baja carga, se observó una fuerte tendencia entre el aumento del porcentaje de tejido conjuntivo renal y el número de Leishmania sp en MO/mm².

* Por último, si se relacionan los parámetros morfométricos de MO, en los animales considerados de baja carga se observa una tendencia a disminuir el tejido hematopoyético y aumenta el estroma en dicho órgano.

CONCLUSIÓN.

Estos resultados demuestran una amplia variabilidad de manifestaciones clínicas, diversidad y magnitud de lesiones macro y microscópicas en riñón y MO en animales infectados naturalmente con Leishmania sp; además, la falta de asociación entre el número de amastigotes de Leishmania sp/mm² en MO y estas lesiones.

No se descarta la posibilidad de que exista asociación cuando se evaluén los parámetros morfométricos del riñón con el número de Leishmania sp presente en este órgano y/o cuando se asocie con el tipo y cantidad de infiltrado inflamatorio del intersticio renal. Con relación a la MO, a pesar de realizar asociación entre parámetros morfométricos y el número de Leishmania sp/mm², tampoco se descarta una relación positiva y/o negativa cuando se cuantifiquen líneas celulares, como ser la mieloidea y eritroidea; por lo que estudio sobre estos puntos serían adecuado para mejor entendimiento de la patogenia de la enfermedad.

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*Dirección para correspondencia: Prof. Dra. Shyrley Paola Amarilla - Departamento de Ciencias Patológicas - Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Asunción - Casilla de Correo N° 1061 - Ruta Mcal. Estigarribia Km 10,5- Campus Universitario - San Lorenzo- Paraguay
E-Mail: ashyrleypaola@yahoo.comz ]]> Recibido: 02 de mayo 2016 / Aceptado: 09 de mayo de 2016