Detección Fenotípica de Carbapenemasas en Pseudomonas aeruginosa en Pacientes que acudieron al Hospital de Clínicas San Lorenzo de febrero a julio 2013

Phenotypic detection of Carbapenemases in P. aeruginosa in patients attending the Hospital de Clinicas in San Lorenzo, from February to July 2013

*Clotilde Ophelie Marie Molin Queste

Laboratorio central del Hospital de Clínicas, San Lorenzo. Facultad de Ciencias Médicas - Universidad Nacional de Asunción.

R E S U M E N

Pseudomonas aeruginosa es uno de los patógenos oportunistas más importantes, causante de infecciones, con altos índices de morbilidad y mortalidad. Los carbapenemes son antibióticos que poseen un amplio espectro de actividad y son altamente potentes, lo cual hacen que sean imprescindibles en el tratamiento empírico. P. aeruginosa presenta diversos mecanismos de resistencia, entre ellos las carbapenemasas tipo metalo-β-lactamasas (MBLs). Debido a los numerosos reportes de bacterias productoras de MBLs, es importante la aplicación de test simples, prácticos y de bajo costo, como pruebas de rutina, para que se pueda identificar a las bacterias productoras de MBLs de forma rápida. El objetivo de este trabajo es determinar fenotípicamente la presencia de carbapenemasas en aislamientos de P. aeruginosa. Estudio prospectivo, descriptivo de corte transversal realizado en aislamientos de P. aeruginosa de pacientes que acudieron al Hospital de Clínicas - San Lorenzo en el periodo de febrero a julio de 2013. Se estudiaron 232 aislamientos de P. aeruginosa, a aquellos con sospecha de carbapenemasas se les aplicó dos métodos de detección fenotípica, discos de EDTA y discos con ácido dipicolinico - Meropenem (DPA-ME). De estos aislamientos, 30 dieron sinergia con la técnica de EDTA y 18 aislamientos positivos con los discos de DPA. A través de los métodos fenotípicos aplicados se pudo comprobar la presencia de cepas productoras de carbapenemasas tipo MBL en una frecuencia de 7,8%. Los tests de combinación de disco podrían ser útiles en la práctica diaria para proporcionar una detección rápida y fiable de MBL carbapenemasas en los aislados de P. aeruginosa cuando las pruebas moleculares no están disponibles.

A B S T R A C T

P. aeruginosa is one of the most important opportunistic pathogens that cause infections with high morbidity and mortality. Carbapenems are antibiotics with a broad spectrum of activity and highly powerful. This makes them indispensable in the empirical treatment. P. aeruginosa has various mechanisms of resistance, including metallobetalactamase (MBL) type carbapenemases Due to the numerous reporst of MBL producing bacteria, it is important to apply simple tests that are practical and inexpensive as routine protocol in order to rapidly identify MBL producing bacteria. The objective of this study was to determine the presence of phenotypically carbapenemases in isolates of P. aeruginosa. A prospective, descriptive cross- sectional study was performed in isolates of P. aeruginosa from patients attending the Hospital de Clinicas - San Lorenzo from February to July, 2013. Two hundred thirty two isolates of P. aeruginosa were studied. Those isolates suspicious of having Carbapenemases were subjected to two phenotypic detection methods: discs of EDTA and discs of dipicolinic acid - Meropenem (DPA-ME). Of these isolates, 30 were synergistic with the technique of EDTA and 18 positively isolated with DPA discs. Through these phenotypic methods the presence of strains producing MBL type carbapenemases was determined at a frequency of 7.8%. The disc combination tests might be very useful in the daily practice to provide fast and reliable detection of MBL carbapenemases in P. aeruginosa isolates, where molecular biology tests are not available.

Keywords: Carbapenemases, MBL, dipicolinic acid, P. aeruginosa

INTRODUCCIÓN

Pseudomonas aeruginosa es uno de los patógenos oportunistas más importantes, causantes de infecciones, con altos índices de morbilidad y mortalidad (1-3). Es considerado un patógeno primariamente nosocomial, siendo común su aislamiento en pacientes de Unidades de Cuidados Intensivos, en quienes además presenta una marcada multirresistencia (4).

El fenotipo “salvaje“ de P. aeruginosa se caracteriza por su sensibilidad a carboxipenicilinas, ureidopenicilinas, ceftazidimas, cefepima, cefoperazona, aztreonam y carbapenémicos, y presenta resistencia natural a muchos antimicrobianos. También desarrolla mutaciones cromosómicas y adquiere material genético que incrementa su resistencia. El número de cepas multiresistentes ha aumentado en los últimos años, y ha hecho que se rescaten antibióticos, como colistina, que se dejaron de usar por su toxicidad, y que en ocasiones es la única opción de tratamiento (5,6).

El conocimiento del perfil de resistencia de los aislamientos de P. aeruginosa en un hospital y la detección de la presencia de carbapenemasas constituyen una información relevante y de gran utilidad para que el sistema de vigilancia y epidemiología del hospital pueda tomar las medidas de contención necesarias para evitar su diseminación.

Estudio prospectivo, descriptivo de corte transversal, en el que se estudiaron aislamientos de P. aeruginosa obtenidos a partir de cultivos de rutina provenientes de pacientes hospitalizados y ambulatorios que acudieron al Hospital de Clínicas - San Lorenzo en el periodo de febrero a julio de 2013.

Para el estudio, se incluyeron todas las muestras que fueron enviadas al laboratorio, con correcta identificación del paciente. Las variables analizadas fueron la presencia o ausencia de carbapenemasas en los aislamientos de P. aeruginosa, los datos del paciente como sexo, servicio del que provenía (UCIA, UCIP, quirófano, CCM, Urología), y el tipo de muestra (orina, secreción purulenta, hemocultivo, líquidos de punción, secreción traqueal).

La identificación y el perfil de resistencia a los antibióticos (MER meropenem, IMP imipenem, AK amicacina, GEN gentamicina, CIP ciprofloxacina, FEP cefepime, CS colistina, CAZ ceftazidima, TZP tazobactam piperacilina) de los aislamientos de P. aeruginosa se realizaron por el sistema Vitek 2C (bioMérieux, Marcy L'Etoile, Francia) y también por la técnica de difusión en disco de Kirby-Bauer, siguiendo las recomendaciones y teniendo en cuenta los puntos de corte de Clínical and Laboratory Standard Institute (CLSI) 2013 (20). Se consideraron los aislamientos con posible presencia de carbapenemasas aquellas con halos de inhibición para ceftazidima (CAZ) ≤ 22 mm por la técnica de difusión en disco y ≥ 16µg/ml (I, R) por vitek-2C y para Meropenem (ME) ≤ 23mm (I,R) y ≥ 1µg/ml.

Una vez determinada la sensibilidad de los aislados a CAZ, IMP y ME, se realizaron los métodos de detección fenotípica de las carbapenemasas: con EDTA (Monodiscos Britania) y KIT ROSCO KPC/MBL (Rosco Diagnostica- Denmark). Los discos de EDTA fueron colocados entre IM y ME a una distancia de 15 mm de borde a borde en una placa de Müeller Hinton, y el KIT ROSCO KPC/MBL que utiliza discos de ME y ME DPA para confirmar la presencia de MBLs.

La lectura e interpretación se realizó después de 24 hs de incubación. Una prueba positiva para los discos de EDTA consiste en el agrandamiento o deformación de la zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de IM y/o ME hacia el disco de EDTA. Con el KIT ROSCO KPC/MBL, se mide la zona de inhibición del disco de ME y de ME-DPA, y una diferencia de halo ≥ 5 mm confirma la presencia de MBLs.

Los datos fueron ingresados en una planilla del programa Microsoft Excel 2010 y posteriormente analizados por el mismo programa utilizando estadística descriptiva.

RESULTADOS

De un total de 232 aislamientos de P. aeruginosa, 54 fueron seleccionados para el estudio, por presentar valores de CIM a CAZ, ME e IM, según Vitek 2C, resistente y/o intermedio. El perfil de sensibilidad a ceftazidima, meropenem e imipenem de los aislamientos de P. aeruginosa se muestra en la Tabla 1.

A los 54 aislamientos seleccionados se les aplicaron los dos métodos fenotípicos, observándose que 30 dieron sinergia por la técnica de doble disco con EDTA: ME - EDTA - IM (Figura 1), mientras que por la técnica con los discos del Kit Rosco KPC∕ MBL, se obtuvieron 18 aislamientos con la probable presencia de carbapenemasa tipo MBLs, observándose una diferencia de halos entre ME y ME-DPA ≥5mm (Figura 2) que corresponde a una frecuencia de 7,8%.

Las muestras biológicas de las que se aislaron P. aeruginosa con probable MBLs fueron orina, secreción traqueal, hemocultivo, secreciones purulentas, líquidos de punción, pero orina (6/18) 33% y secreción traqueal (5/18) 28% fueron los más frecuentes. El 61% de los aislamientos fue de muestras de pacientes del sexo masculino. El 95% de los aislamientos provenía de internados adultos de diferentes salas: UCIA (38%), Cátedra de Clínica Médica (28%), Urgencias Adultos (18%), Urología (5%), Traumatología (5%) y el 5% provenía de Consultorio Externo.

En el perfil de sensibilidad para P. aeruginosas portadoras de probable MBLs se observó 100% de resistencia a meropenem, gentamicina, ciprofloxacina, 94% a imipenem y piperacilina tazobactam, 61% a ceftazidima, 44% a amikacina y 33% a cefepime. Así también se observó sensibilidad del 100% para colistina, 56% para amikacina, y 6% para imipenem, cefepime y piperacilina tazobactam. Los valores intermedios fueron registrados para imipenem 6%, cefepime 61% y ceftazidima 39% (Figura 3).

DISCUSIÓN

La detección de MBLs en P. aeruginosa constituye un hecho observable en todos los países del mundo, lo cual denota una frecuencia creciente en los últimos años (21). Las P. aeruginosa MBLs en el ámbito hospitalario se asocian con un problema clínico importante, así como a programas de control de infecciones, por lo que se requiere disponer de métodos diagnósticos confiables y precisos para su identificación (22,23).

La P. aeruginosa productora de MBLs se identificó por primera vez en Japón en 1991 (24). En un estudio multicentrico realizado en Paraguay en 2011 -2013, de 671 bacilos gram negativos no fermentadores portadores de la enzima MBLs, se obtuvieron 20 aislamientos de MBLs, correspondiente a un 3%, de éstos 5 resultaron ser P. aeruginosa Se realizaron pruebas de sinergia con EDTA, métodos microbiológicos y moleculares(25).

En este estudio, de un total de 232 aislamientos de P. aeruginosa, 30 de ellas dieron sinergia por la técnica de doble disco con EDTA, lo que sugiere la presencia de un método enzimático muy probablemente producción de MBL, con los discos de DPA-ME se obtuvieron 18 P. aeruginosa con probable MBL. Esta diferencia puede deberse a que el método de doble difusión con EDTA tiene el inconveniente de producir falsos positivos (26,27), debido a que el EDTA es capaz de aumentar la permeabilidad de la membrana externa, incrementando asi la susceptibilidad a P.aeruginosa y Acinetobacter spp a varios antimicrobianos (27). En cuanto a los discos de DPA, éstos presentan una sensibilidad y especificidad de 97% y 81% respectivamente (19), por lo que estos resultados se deberían confirmar por biología molecular, ya que son las técnicas de referencia para detectar la producción de MBL, pero no son aplicables en todos los laboratorios por su elevada complejidad y costo. Por ello, el uso de estos métodos fenotípicos resultan útiles para su uso diario en los laboratorios de baja complejidad para detectar la presencia de MBL en forma rápida, eficaz, sencilla, confiable y sobre todo de bajo costo.

Este es el primer estudio fenotípico utilizando el KIT de ROSCO KPC/MBL que demuestra la presencia de enzimas MBLs en aislados de P. aeruginosa, en el Hospital de Clínicas de Paraguay - San Lorenzo, obteniendo una frecuencia de 7,8%. Comparando con otros estudios realizados en América del Sur para la detección de MBLs en aislamientos de P aeruginosa hay una cierta similitud en los resultados, se observa que la frecuencia en Perú fue del 7% (28), en Argentina fue del 14% (29), en Brasil 8,2% (30), y en Colombia 11,7% (10).

Las muestras biológicas de las que se aislaron mayor porcentaje de P. aeruginosa con probable MBLs fueron orina (6/18) 33% y secreción traqueal (5/18) 28%, lo que sugiere enfatizar más la búsqueda en dichos materiales. Los mismos provenían de UCIA (38%), Cátedra de Clínica Médica (28%), Urgencias Adultos (18%), Urología (5%), Traumatología (5%) y Consultorio (5%). Este fenómeno, que antes estaba limitado a las unidades de cuidados intensivos, se ha diseminado a otras áreas de hospitalización creando datos alarmantes en la morbi-mortalidad de cada hospital.

Según el perfil de sensibilidad para los 18 aislamientos de P. aeruginosa se observó que el 100% de ellos era sensible a colistina, sin embargo, con los demás antibióticos la sensibilidad fue menor, así la sensibilidad para amikacina fue de 56%, y para imipenem, cefepime, piperacilina tazobactam fue de 6%. Por lo tanto se puede decir que la droga de elección, en terapias combinadas sigue siendo la colistina a pesar de su toxicidad (5). El conocimiento de la epidemiologia y de los perfiles de susceptibilidad a los antibióticos propios de cada unidad hospitalaria es de gran utilidad ya que proporciona herramientas sólidas a los médicos responsables de la toma de decisión en el manejo de pacientes con infección grave.

Es necesario continuar buscando MBLs en P. aeruginosa en un perfil de antibiótico que lo indique, especialmente en muestras de orina y de vías respiratorias, usando el método de difusión por monodisco de EDTA y el KIT de ROSCO KPC/MBL, a fin de mejorar la sensibilidad. La confirmación mediante PCR constituye un paso posterior importante y confirmatorio de la presencia de MBLs. La detección rutinaria de MBLs garantizará la atención óptima del paciente y la introducción oportuna de medidas de prevención.

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Fecha de recepción: noviembre 2015. Fecha de aceptación: febrero 2016
Autor correspondiente: *Clotilde Molin. Laboratorio central del Hospital de Clínicas, Facultad de Ciencias Médicas - Universidad Nacional de Asunción.
Email: cottymolinar@hotmail.com