Concordancia entre las pruebas de ELISA avidez IgG desarrollados en el Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud y un ELISA avidez comercial
Concordance between the IgG avidity ELISA tests developed at the Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud and a commercial avidity ELISA
*Acosta MEI, Guillen YI, Aria LI, Meza TI, Roig CI, Carpinelli MII, Díaz CIII
IDepartamento de Producción Bioquímica del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud
IIDepartamento de Inmunología del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud ]]>
IIICentro Materno Infantil de San Lorenzo
RESUMEN
La infección aguda de toxoplasmosis en la mujer durante el embarazo en su mayor parte es asintomática y detectable solo por anticuerpos lo que podría afectar severamente al feto si no es diagnosticada y tratada precozmente. En este estudio observacional analítico de corte transverso se comparó la prueba de ELISA Avidez IgG para toxoplasmosis desarrollado en el Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS) con un test comercial de avidez InmunoLISA Organics USA. Para la concordancia se utilizó 41 sueros mantenidos a -20 ºC procedentes de la seroteca del Departamento de Producción-Bioquímica seleccionados al azar. La concordancia obtenida fue de 92.7% y un índice de Kappa de 0.820 con IC95% (0.6-1) y p<0.0001. El índice bajo de avidez sugiere una infección aguda pero para el diagnóstico debería estar acompañado de otras pruebas serológicas y la clínica del paciente. En cambio un índice alto es diagnóstico de una infección crónica.
Palabras claves: Toxoplasma gondii, avidez, diagnóstico.
ABSTRACT
The acute infection caused by Toxoplasma gondii in pregnant women is mostly asymptomatic and detectable only by antibodies that could severely affect the fetus if the infection is not diagnosed and treated precociously. In this cross-sectional observational, the analytical the IgG avidity ELISA test for toxoplasmosis, developed at the Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS), was compared to a commercial avidity kit InmunoLISA (Organics, USA). For the concordance, 41 serum samples kept at -20ºC at the Department of Production-Biochemistry of IICS were tested. The concordance obtained was 92.7% and a Kappa index of 0.820 with IC95% (0.6-1) and p <0.0001. The low avidity index suggests an acute infection but for diagnosis this result should be accompanied by other serologic tests and clinical symptoms. Instead, a high avidity index suggests a chronic infection.
]]> Keywords: Toxoplama gondii, avidity, diagnosis.INTRODUCCIÓN
La toxoplasmosis es una zoonosis parasitaria causada por un parásito unicelular e intracelular obligado: Toxoplasma gondii. El huésped natural y definitivo es el gato (felinos) (1). La forma de transmisión se da por la ingestión de ooquistes, transmisión congénita, transplante de órganos, accidentes laboratoriales y transfusión de sangre entera y leucocitos (2-4).
El diagnóstico de la toxoplasmosis se ha orientado hacia la búsqueda de nuevas técnicas para la detección de infecciones recientes que por lo general son clínicamente asintomáticas (5), en especial para el diagnóstico en las embarazadas debido al alto riesgo de transmisión al feto si la primo infección ocurre durante los meses de gestación.
Las pruebas que buscan anticuerpos IgM, IgG, IgA, IgE se realizan por ensayos como inmunofluorescencia indirecta (IFI), prueba inmunoenzimatica (ELISA), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el ELISA de avidez IgG (6,7).
En un estudio realizado en el Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS) en 1997 para la detección del índice de avidez de IgG en un grupo de mujeres embarazadas con infección aguda y crónica, se encontró un índice de avidez bajo con una media de 1.09+/-0.33 en las primeras y en las pacientes crónicas un índice de avidez alto de 1.91+/-0.18, detectándose una diferencia significativa entre ambas poblaciones (p<0.05) (8). La prueba de ELISA avidez IgG consiste en un ensayo inmunoenzimático en el cual un agente desestabilizante de puentes de hidrógeno, como la urea y el tiocianato, es empleado para disociar la unión entre las IgG específicas y el antígeno, de tal forma que en infecciones recientes las IgG de baja avidez son casi totalmente disociadas del complejo antígeno–anticuerpo, mientras que infecciones crónicas de alta avidez permanecen mayormente unidas a los antígenos del T.gondii.
La técnica desarrollada por Pullén (9) es la que implementamos en el laboratorio para la detección del índice de avidez.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Diseño: Se llevó a cabo un estudio observacional analítico de corte transverso.Población: Para la concordancia con el test comercial: 41 sueros mantenidos a -20ºC procedentes de la seroteca del Departamento de Producción-Bioquímica del IICS, fueron codificados y seleccionados al azar, 19 de ellos fueron IgG e IgM positivos por distintos métodos serológicos, 15 sueros IgG positivos e IgM negativos por el método serológico de quimioluminiscencia y 7 sueros de pacientes con clínica y serología de toxoplasmosis aguda, todos fueron procesados por el test de Avidez IgG para toxoplasmosis desarrollados en el IICS y el comercial InmunoLISA avidity IgG Organics USA.
Determinación de las inmunoglobulinas IgG e IgM para Toxoplasma gondii:
Fueron testados por los métodos serológicos comerciales: ELISA Indirecto (InmunoLISA,Organics-USA) quimioluminiscencia (Inmulite toxoplasma cuantitativa IgG), IFI(Toxo-Spot IF Biomeriux).
Avidez IgG para toxoplasmosis desarrollado en el IICS
Las microplacas fueron sensibilizadas con un antígeno comercial de T. gondii, el procedimiento consistió primeramente en utilizar el ELISA indirecto realizando varias diluciones del suero desde 1/50 hasta 1/6400 a fin de obtener la dilución óptica ideal cercana a 1 (0.8 a 1.1) los tiempos de incubación fueron los mismos que el ELISA de avidez. Posteriormente se realizó un segundo ELISA con la dilución óptima determinada, se incubó durante 2 horas a 37ºC, sin lavado previo se le agregó tiocianato de potasio (KSCN) en diferentes concentraciones (0,5, 1, 2, 2,5 y 3 molar) dejando los dos primeros pocillos con solución de lavado los cuales sirvieron de control, esto se incubó con agitación suave a temperatura ambiente durante 15 minutos y posteriormente se realizaron los tres lavados. Se adicionó 100 ul el anti IgG humano conjugado con peroxidasa, se incubó durante 2h a 37°C, se volvió a lavar tres veces, se agregó el cromógeno (ABTS) y se leyó a la densidad óptica de 405 nm con un lector de microplacas Bio-Rad.
Índice de avidez: Es calculado como porcentaje de elusión (% del elusión) para cada concentración de tiocianato que es definido como el cociente Absorbancia (A)450 de la concentración sin tiocianato A450 de la concentración con KSCN. El índice de avidez (AI) fue definido como la concentración molar de KSCN que eliminó el 50% del anticuerpo sin tratamiento. Este valor fue colocado para cada muestra del suero de la regresión lineal Ln (% de elusión) contra la concentración molar de KSCN.
Los valores utilizados como referencia fueron:
Avidez IgG para toxoplasmosis InmunoLISA ORGENICS
Se determinó el índice de avidez de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Las microplacas fueron sensibilizadas con antígeno de T. gondii, en la primera incubación hay una reacción con el anticuerpo del suero del paciente IgG anti toxoplasmosis. Después del lavado de todos los componentes, en la segunda incubación a unión antígeno anticuerpo fueron tratados con solución fisiológica (referencias) y agente desnaturalizante capaz de disociar a las uniones de anticuerpos de baja avidez con el antígeno. Después del lavado en la tercera incubación se agregó el conjugado IgG anticuerpo antihumano conjugado anti peroxidasa. La enzima de captura sobre la fase sólida actúa sobre la mezcla sustrato/cromógeno, generando una señal que es proporcional al aumento de los anticuerpos anti T.gondii IgG presentes en la muestra. Las microplacas se leyeron a 450 nm y 620 el blanco.
Se calculó el índice de Avidez (AI) entre DO450 nm con solución fisiológica(A) y DO 450 con desnaturalizante (B) usando la siguiente formula AI:B/A.
Valores
Análisis estadísticos
]]> El análisis estadístico de los resultados fue hecho empleando el software Epiinfo versión 2002 para la evaluación de la significancia entre los test serológicos se utilizó el test no paramétrico de Chi cuadrado, y Epidata 2.2 para la concordancia con una P <0.05.Asuntos éticos
Los sueros utilizados en este estudio pertenecen a la seroteca del Dpto. de Producción Bioquímica del IICS los cuales fueron codificados, respetando la confidencialidad de los mismos. Estos pacientes no tendrán beneficio directo, pero darán un aporte importante para la estandarización del test, el cual será utilizado como método diagnostico a favor de la comunidad.
RESULTADOS
En base a los resultados obtenidos de los 41 sueros representados en la tabla 1 se calculó la concordancia entre el test de avidez IgG comercial InmunoLISA Organics y avidez IgG desarrollado en el IICS para toxoplasmosis, donde se obtuvo un 92.7% de concordancia con un índice de Kappa de 0.820 a un IC95% (0.626-1) y p<0.0001.
Las muestras de pacientes con serología positiva de los distintos métodos serológicos (ELISA indirecta, quimioluminiscencia e IFI) fueron utilizadas para comparar con los índices de avidez del test desarrollado en el IICS. Los 24 sueros con serología negativa para IgM por los diversos métodos mostraron un índice de avidez mayor a 1.5 M que nos indica una infección crónica. De las 19 muestras con serología IgM positiva 10 de ellas dieron valores de índice de avidez entre 0.5 a 1 M lo que nos sugieren una probable infección aguda y 9 de estas dieron valores de índice de avidez mayores a 1.5 M que corresponde a una infección crónica.
]]> Se ha encontrado en este estudio preliminar una muy buena concordancia entre el test de avidez de IgG anti T. gondii comercial y el desarrollado en el IICS, dado que el valor estimado del índice Kappa para estos datos fue de 0.820, utilizando la escala de Landis y Koch (10).
DISCUSION
Las diferencias encontradas entre los tests serológicos y el test de avidez fueron estadísticamente no significativas como las encontradas en otras bibliografías (11). Se pudo corroborar que los sueros de los pacientes con serología y clínica positiva presentaron un bajo índice de avidez de IgG menor a 0.5M lo cual confirma el diagnóstico de infección aguda. En los sueros con serología positiva IgM sin diagnóstico clínico se observó una variación en los índices de avidez desde 0.5 a 1.5M, en cambio la mayoría de los sueros con serología negativa para IgM mostraron un índice mayor a 1.5M. Estos resultados se han observado también en otras publicaciones en la que una serología positiva para IgM sin el acompañamiento clínico no significa necesariamente una infección aguda ya que el índice de avidez con un valor bajo al igual que la IgM pueden persistir dentro de los 12 meses de la post infección(8).Algunas de las posibles causas de la discrepancia entre los métodos serológicos que determinan las inmunoglobulinas del tipo IgM y el test de avidez IgG desarrollado en el IICS podrían deberse a la preparación del antígeno, al método utilizado y al valor del cut off (11,12).
El empleo de la prueba de avidez IgG anti T.gondii desarrollado en el IICS mostró una muy buena concordancia de 0.82 con el test de avidez IgG InmunoLISA Organics USA. Este test detecta índice de avidez bajo en una infección aguda el cual podría ser utilizado como diagnóstico siempre que esté acompañado de otras pruebas serológicas para IgG e IgM y de la clínica del paciente; en cambio un índice de avidez alto nos confirma una infección crónica. La disponibilidad de una prueba complementaria para el diagnóstico de una infección aguda de toxoplasmosis será un servicio útil para la mujer embarazada.
AGRADECIMIENTO
Este estudio ha sido posible gracias al apoyo económico de la Japan International Cooperation Agency (JICA).
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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*Autor Correspondiente: Dra María Eugenia Acosta. Dpto. de Producción Bioquímica
Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud. Río de la Plata y Lagerenza. Asunción-Paraguay
Email: produccion@iics.una.py. Fecha de recepción: Marzo de 2010, Fecha de aceptación: Octubre de 2010