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INTRODUCCIÓN
Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) actúa como el principal vector del virus de fiebre amarilla urbana, virus dengue, chikungunya y zika1-4. El género Aedes está constituido por más de 500 especies, la de mayor trascendencia en el hemisferio occidental es Ae. aegypti5.
En los primeros meses de 2020 en América, el número de casos notificados fue superior a 1,6 millones, lo que se tradujo en la necesidad de seguir con las acciones para eliminar los criaderos de los mosquitos transmisores, incluso durante la pandemia por COVID-196. En Paraguay, durante los primeros seis meses del año 2021, las notificaciones de casos sospechosos ascendieron a 11.505, mientras que los casos registrados y confirmados llegaron a 1.910. Así, en algunos departamentos del Chaco se registraron tasas de notificación de más de 500 casos/100.000 habitantes y en Central y Asunción se notificaron entre 101 a 500 casos/ 100.000 habitantes7.
En la lucha anti vectorial, las entidades de salud pública han recurrido a varios tipos de controles o combinaciones de ellos8, entre las estrategias más utilizadas para mantener al margen a las poblaciones de Ae. aegypti se encuentra el control químico, mediante larvicidas o adulticidas, aplicados sobre los diferentes estadios de desarrollo de los vectores9. El tratamiento focal con adulticidas y el éxito del mismo, está influenciado por las condiciones adversas del medio ambiente, los métodos de aplicación de éstos y el estilo de vida de los pobladores10,11. Estas diversas condiciones hacen que los insectos vectores presenten tolerancia a niveles de la dosis letal del insecticida, lo que genera su resistencia frente a los mismos12.
Los adulticidas piretroides actúan sobre la membrana plasmática de las neuronas del insecto, provocando un retraso en el cierre de los canales de sodio (voltaje-dependientes) y son considerados altamente tóxicos para los mosquitos, con escaso efecto sobre los mamíferos. Estas propiedades, así como la utilización de dosis reducidas durante su aplicación, la corta persistencia y escasa bioacumulación en el ambiente, permiten su utilización en el control del vector13,14.
En estudios realizados en Argentina se han detectado poblaciones de Ae. aegypti susceptibles al piretroide deltametrina, no así frente al adulticida cipermetrina, frente al cual las mismas poblaciones se mostraron resistentes15. En Paraguay un estudio previo realizado sobre Ae. aegypti silvestre, colectado en Ciudad del Este, Alto Paraná, demostró resistencia frente a deltametrina16 y existen registros de resistencia para deltametrina en varios municipios del Departamento Central (datos no publicados). En relación a la infestación larvaria, el Servicio Nacional de Erradicación del Paludismo (SENEPA) declaró al municipio de Villa Elisa en alerta epidemiológica, debido a que en el año 2018 se registraron índices de infestación entre 8,6 % y 9,5%, indicativo de riesgo para la presencia del vector y para brotes de arbovirosis, si se considera que valores mayores a 1% indican alerta y mayores a 4 %, elevado riesgo de transmisión17.
Debido a esta situación se planteó un estudio de resistencia y/o susceptibilidad en el municipio de Villa Elisa, con el fin de investigar la resistencia a deltametrina y los factores ambientales que favorecerían la presencia del vector, mediante bioensayos dosis-diagnóstica y mapeo de la distribución de estas poblaciones y sus áreas de influencia con herramientas de información geográfica. Los datos relevantes de las poblaciones de vectores que circularon para el momento del estudio, constituyen un aporte al desafío que se presenta actualmente con la aparición simultánea de infecciones por arbovirus (Dengue) y por Covid-19, ambos con capacidad de causar enfermedades graves, e incluso la muerte.
La información obtenida constituye un primer registro, debido a que no existen datos publicados de susceptibilidad a piretroides adulticidas con poblaciones de mosquitos Ae. aegypti procedentes del municipio de Villa Elisa, Paraguay.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño y Área de estudio
El estudio fue propuesto como un abordaje descriptivo, experimental y transversal, el cual contempló la ejecución de bioensayos para dosis diagnóstica de resistencia/susceptibilidad frente a piretroides, en mosquitos adultos Ae. aegypti.
Los insectos fueron colectados de la ciudad de Villa Elisa, Paraguay, una de las ciudades más importantes y de gran actividad económica del área metropolitana, que se encuentra a 16 km de la capital del país. En el 2021 se registró, para Villa Elisa, una población 82.491 habitantes de los cuales el 53,38%, eran menores de 30 años18, es decir compuesta por población joven, laboralmente activa y probablemente de alta movilidad. La ciudad cuenta con numerosos establecimientos industriales, comerciales y de servicios, imbricada en 16 barrios, muchos de los cuales han presentado altos índices de infestación larvaria por el mosquito Ae. aegypti (9,49%)19.
Las características tales como; la cercanía a la capital, fenómenos de migración campo/ciudad, presencia de otras ciudades aledañas, la proximidad a puertos y el acelerado crecimiento poblacional20, que propiciarían el gran flujo humano con el consecuente transporte y domiciliación de Ae. aegypti, fueron los criterios de escogencia de este distrito para el estudio.
Muestreo y colecta de material biológico.
Se aplicó un muestreo por conveniencia en áreas peri domiciliares de 20 viviendas de Villa Elisa, con características ad hoc para la presencia del vector, tales como vegetación circundante, presencia de animales domésticos, áreas húmedas y sombreadas, presencia contenedores de agua, utensilios acumulados en el peri domicilio que servirían de potenciales criaderos, entre otros.
La colecta de huevos se llevó a cabo en el año 2018, según la metodología de Fay y Eliason21. Los puntos de colecta fueron georreferenciados para la modelación de la distribución geográfica (Figura 1). Las ovitrampas fueron colocadas en al menos dos sitios del peri domicilio, y las mismas fueron recuperadas a los siete días, posterior a la instalación, para su procesamiento y discriminación de presencia/ausencia de huevos. Los procedimientos se llevaron a cabo en el insectario del Dpto. de Medicina Tropical del Instituto de Investigaciones de la Universidad Nacional de Asunción y en el laboratorio de Fisiología y Control de Artrópodos Vectores (LAFICAVE), Fiocruz, Brasil.
Figura 1. Mapa del Departamento Central-Paraguay y regiones limítrofes con destaque de áreas de muestreo (período 2018) de subpoblaciones silvestres de Aedes aegypti en el municipio de Villa Elisa (DIVA GIS software) (área de líneas diagonales= departamento Central; área en gris sólido= Villa Elisa distrito de muestreo)
Establecimiento y mantenimiento de la colonia de Ae. aegypti.
Se estableció la colonia de Ae. aegypti a partir de los huevos hidratados con agua libre de cloro, los cuales fueron mantenidos a 26 °C +/- 2°C y 60% +/-10% de humedad relativa, con un fotoperiodo de 12 hs22. Las larvas fueron alimentadas hasta llegar a la fase adulta, de las cuales se obtuvieron la colonia parental y la progenie (filial 1 o F1). Los machos fueron alimentados con agua azucarada al 10% ad libitum y las hembras se alimentaron con sangre de ratones Swiss albinos, comprobadamente sanos, mantenidos en condiciones ad hoc de bioterio, previamente sedados y anestesiados, ajustándose a las normativas del Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas para uso de animales de laboratorio23.
Ensayos de dosis diagnóstica
Para evaluar la dosis diagnóstica de susceptibilidad/resistencia, se realizaron tres bio-ensayos con papeles impregnados con el insecticida deltametrina (C22H19Br2NO3; Dr. Ehrenstorfer®) de 99,7% de pureza (PA). Los controles consistieron en papeles impregnados con solventes para piretroides24. Los ensayos se realizaron en días diferentes, en los cuales se expusieron a cuatro grupos (réplicas para cada concentración) de hembras de la F1 (23 ejemplares/grupo) al contacto con papeles impregnados con: a) deltametrina al 0,03%, que consistió en la dosis diagnóstica o el doble de la dosis letal para el 99,9% (CL99,9) de la población susceptible de referencia (cepa “Rockefeller”; laboratorio LAFICAVE, Brasil), b) deltametrina al 0,15 %, que consistió en cinco veces la dosis diagnóstica y c) deltametrina al 0,3 % que consistió en diez veces la dosis diagnóstica. Como control se emplearon papeles libres de insecticidas impregnados con silicona dow corning ®( 25. Las hembras fueron expuestas durante 60 minutos y transferidas a cilindros libres del insecticida. A las 24 horas post exposición, se registró el número de mosquitos caídos (knock down) que permitió registrar el porcentaje de mortalidad, según los parámetros de la OMS que sugiere susceptibilidad (mortalidad ≥ 98%), posible resistencia (mortalidad 90 - 97%, que derivaría en análisis moleculares para determinar presencia de genes de resistencia) y resistencia confirmada (mortalidad menor al 90%)25. Se tomó como criterio de mortalidad aquellos mosquitos que no pudieron levantarse, volar o moverse.
Estudio de la distribución de poblaciones de Ae. aegypti en el municipio de Villa Elisa.
Con los registros de geolocalizados de ovitrampas positivas, se elaboró una base de datos para la presencia de Ae. aegypti en el área de estudio. La modelación de la distribución real y el área de influencia, declarada en alerta epidemiológica por los índices de infestación larvaria elevados (año 2018), se realizó mediante el software DIVA-GIS v. 7.3.0, para la generación de mapas ráster de distribución, generados en función de variables ambientales que permitieron conocer las áreas con condiciones idóneas para su presencia. La modelación resultó de la interpolación de datos de temperatura media (máximos y mínimos), precipitación mensual y datos de altitud, desde el año 1950 hasta más de 50 años, que son utilizados en la actualidad26. Las 19 variables disponibles en Global Climate Data-WorldClim, en formato ráster, circunscritas a la geografía del Paraguay, con resolución espacial de 1 km2 en el Ecuador, se describen en la tabla 1.
Tabla 1. Variables bioclimáticas (Global Climate Data-WorldClim) utilizadas en la generación del modelo de distribución espacial de Ae. aegypti en el municipio de Villa Elisa, Central - Paraguay.
| Bio1 | Temperatura media anual |
| Bio2 | Rango de temperatura diurna media (Temp. Máx-Temp. Mín) |
| Bio3 | Isotermalidad (Bio2 / Bio7) (* 100) |
| Bio4 | Estacionalidad de la temperatura (desviación standard*100) |
| Bio5 | Temperatura máxima del mes más cálido |
| Bio6 | Temperatura mínima del mes más frío |
| Bio7 | Rango de temperatura anual (Bio5 - Bio6) |
| Bio8 | Temperatura promedio del trimestre más húmedo |
| Bio9 | Temperatura promedio del trimestre más seco |
| Bio10 | Temperatura promedio del trimestre más cálido |
| Bio11 | Temperatura promedio del trimestre más frío |
| Bio12 | Precipitación anual |
| Bio13 | Precipitación del mes más húmedo |
| Bio14 | Precipitación del mes más seco |
| Bio15 | Estacionalidad de la precipitación (coeficiente de variación) |
| Bio16 | Precipitación del trimestre más húmedo |
| Bio17 | Precipitación del trimestre más seco |
| Bio18 | Precipitación del trimestre más cálido |
| Bio19 | Precipitación del trimestre más frío |
Análisis de los datos
Los resultados de resistencia/susceptibilidad fueron analizados mediante estadística descriptiva, para determinar proporciones y medidas de tendencia central, en el comportamiento de mosquitos frente al control químico según los criterios establecidos por la Organización Mundial de la Salud (W.H.O)25. Las diferencias en cuanto a la exposición de la población silvestre de Ae. aegypti de Villa Elisa, a diferentes concentraciones del adulticida, fueron analizadas con pruebas de Kruskal Wallis.
Consideraciones Éticas
La utilización de animales de laboratorio para la alimentación sanguínea de las hembras de Ae. aegypti se realizó con el menor número posible y se aplicó a cada animal, sedantes y analgésicos que paliaron el dolor y la angustia. Este estudio formó parte de un proyecto macro aprobado por los comités científico y de ética del Instituto de Investigaciones de Ciencias de la Salud con código P26/2015.
RESULTADOS
Del 100% de las ovitrampas recuperadas se obtuvo 61,3% de paletas positivas con huevos del género Aedes (982 huevos contabilizados).
Las pruebas realizadas con las concentraciones 5X (0,15) y 10X (0,3) a partir de la concentración discriminante diagnóstica del insecticida (0,03), evidenciaron mortalidad de los mosquitos en todas las concentraciones utilizadas, inferior al 90% (variando entre 1-60%). En más detalle, las proporciones medias de mortalidad fueron de 5,3% para (0,03%); 47,4% para (0,15%) y 61,2% para (0,3%); así el porcentaje de mortalidad promedio en los tres ensayos a la concentración discriminante más alta, fue de 61,2% (Tabla 2; Figura 2). La población evaluada fue resistente a deltametrina, según el criterio estándar establecido25.
Tabla 2. Susceptibilidad a deltametrina en poblaciones de Ae. aegypti procedentes del municipio de Villa Elisa, Central - Paraguay.
| Primer ensayo | |||
|---|---|---|---|
| Proporción de concentración discriminante (%) | Expuestos | Mortalidad*** | Proporción de mortalidad (%) |
| 0 * | 40 | 0 | 0 |
| 0.03 ** | 76 | 1 | 1.32 |
| 0.15 (5 X) | 88 | 40 | 45.45 |
| 0.35 (10X) | 78 | 47 | 60.26 |
| Segundo ensayo | |||
| 0* | 40 | 0 | 0 |
| 0.03** | 119 | 6 | 5.04 |
| 0.15 (5 X) | 112 | 51 | 45.53 |
| 0.35 (10X) | 119 | 71 | 59.63 |
| Tercer ensayo | |||
| 0* | 40 | 1 | 2.5 |
| 0.03** | 84 | 8 | 9.5 |
| 0.15 (5 X) | 80 | 41 | 51.25 |
| 0.35 (10X) | 77 | 49 | 63.67 |
*Control **Concentración discriminante base -OMS ***Valores promedios de réplicas
Figura 2. Promedio de porcentaje de mortalidad de las réplicas sometidas a diferentes concentraciones de deltametrina.
La prueba de Kruskal-Wallis que determina la similitud de los valores medios obtenidos en cuanto a porcentajes de mortalidad, reveló diferencias significativas entre los valores de las medianas para cada grupo de réplicas, a concentraciones crecientes (p = 0.03207). Estos resultados indican que la mortalidad aumentó significativamente con el aumento de la concentración de deltametrina, sin embargo, los grupos de réplicas, no alcanzaron el porcentaje esperado de 98% de mortalidad, que indicaría la susceptibilidad de la población de Ae. aegypti al adulticida utilizado en este ensayo.
Áreas de idoneidad bioclimática para presencia de poblaciones de Ae. aegypti en el municipio Villa Elisa, Central - Paraguay.
Mediante Diva Gis se logró obtener el mapa de distribución de áreas idóneas de presencia de Ae. aegypti. El área cuadrática sombreada destaca el área de alta probabilidad (percentil 20-25 de descarte) en la que podría encontrarse al vector, aun cuando no se haya registrado para el momento de este estudio26) (Figura 3).
Estas áreas de influencia fueron los distritos de Lambaré, Ñemby, Fernando de la Mora, San Lorenzo y San Antonio, las cuales coinciden, geográficamente con la presencia de numerosos arroyos tales como el Arroyo Fortín Mbachió, Rosedal, Arroyo Seco y el Rio Paraguay. El análisis de las variables determinantes del modelo, reveló que la precipitación anual fue el factor de mayor influencia en la presencia y distribución de Ae aegypti en Villa Elisa.
DISCUSIÓN
Los compuestos piretroides, entre los que se encuentra el adulticida deltametrina, frecuentemente han sido reportados con resultado exitoso, en cuanto al control químico vectorial, tanto en pruebas de laboratorio como en campo, por lo que son de amplio uso en programas nacionales de control de vectores27. Sin embargo, el uso prolongado de los compuestos químicos para el control, ha conllevado a la selección de poblaciones de vectores resistentes a dichos compuestos. La deltametrina tiene baja toxicidad para los animales de sangre caliente, no presenta efectos teratogénicos y tiene un riesgo mínimo para la salud humana, por lo que se ha normalizado su uso. Como antecedente se menciona que el programa de control vectorial llevado a cabo por el Servicio Nacional de Erradicación del Paludismo (SENEPA), ha aplicado deltametrina en sus campañas de control hasta el año 201528. En 2007 SENEPA refirió que Ae. aegypti no presentaba resistencia a deltametrina, por lo que se justificaba su uso29, lo cual implicó una compra de 20.000 L de este adulticida al 2%, por parte de la entidad dependiente del Ministerio de Salud Pública, para utilizarlo en las campañas de control químico (años 2013-2014)30. En el año 2015, a raíz de los estudios que revelaron alta resistencia a piretroides, en poblaciones de Ae. aegypti de Asunción y Ciudad del Este, se determinó el cambio del insecticida (según recomendación OMS) por Clorpirifos y Malatión31. Sin embargo, en la actualidad en varios municipios del Departamento Central se sigue utilizando deltametrina para el control vectorial de mosquitos adultos, por lo cual en la actualidad permanecen aún algunas poblaciones de mosquitos Ae. aegypti resistentes. Es por ello que la rotación de insecticidas es de gran importancia para el control de los vectores, esta se basa en que en los primeros eventos de selección, los individuos resistentes poseen una capacidad biótica más baja en relación a los susceptibles, visible en el acortamiento del tiempo de vida, variaciones en el tiempo de eclosión de los huevos y en la viabilidad de los mismos (costo de la resistencia). Así, la disminución en la frecuencia de los insectos resistentes se da con el reemplazo del agente químico al seleccionar un insecticida alternativo para evitar la resistencia cruzada32.
Otros aspectos que se deben considerar para el éxito del control químico consisten en el material con el que se construyen y revisten las viviendas, lo cual condicionaría la residualidad y el contacto del producto químico con los vectores; como ejemplo se pueden mencionar la tierra y barro los cuales retienen más al insecticida en relación a materiales como azulejos y cerámica33.
Por otra parte, se debe considerar la mayor o menor duración del ciclo de vida del vector, el cual puede ser alterado por cambios climatológicos relacionados como temperatura, humedad relativa y pluviosidad; lo que conduce a diferentes tiempos de exposición al insecticida32,33.
Las poblaciones de Ae. aegypti, colectadas en viviendas de Villa Elisa, mostraron alta resistencia a deltametrina, concordando con los registros encontrados en las poblaciones de Ciudad del Este (Alto Paraná) y Asunción (Central), que de forma similar presentaron resistencia alta (RR > 20) frente al mismo compuesto (16,34. Esta alta resistencia a piretroides, probablemente puede ser atribuido a su uso ininterrumpido desde 1991 hasta el 2015 (14 años)28.
La presencia de mosquitos Ae. aegypti hembras, que circulan en ambientes domiciliares y peridomiciliares de Villa Elisa, así como sus posibles criaderos, se suma a la idoneidad de Lambaré, San Antonio, Fernando de la Mora, San Lorenzo y Ñemby, como áreas con condiciones bioclimáticas (precipitación anual de 1400-1480 pp) adecuadas para el vector, altamente urbanizadas y cercanas a numerosos arroyos y al Río Paraguay. Entre 2018 y 2019, en Villa Elisa se registraron índices de infestación larvaria de 9,49 % y 17.20 %, respectivamente19, los cuales pueden ser considerados alarmantes ya que superan el valor máximo (>1%) de riesgo para brotes de dengue.
El estudio de poblaciones de mosquitos resistentes y los hábitats o localidades geográficas en los cuales se distribuyen, llama a la necesidad de supervisar las campañas de control químico de vectores, el éxito de las mismas y por ende el corte del surgimiento de nuevos brotes de enfermedades25.
Las pruebas de susceptibilidad a insecticidas sirven para distinguir entre el nivel de susceptibilidad de referencia y la resistencia a los insecticidas de uso frecuente, que llevan a mejorar el sistema de vigilancia de vectores en campo.
Siendo que el dengue, por su morbimortalidad, impacto económico y social ha afectado fuertemente al Paraguay, se plantea hoy día, mitigar su efecto, basado en el empoderamiento de la ciudadanía en la vigilancia y eliminación de criaderos, y el uso racional de insecticidas, en forma doméstica, para mantener un entorno saludable19.
Se puede afirmar que los resultados obtenidos en el presente estudio, basados en los bioensayos, evidencian que hay regiones reales y potenciales dentro del Departamento Central, en las cuales se presenta alta resistencia a deltametrina en poblaciones naturales de Ae aegypti, coincidiendo con estudios previos similares ya realizados en Asunción34. Estos procesos de resistencia deberán ser estudiados con otros abordajes, especialmente desde el punto de vista molecular, con el fin de conocer si se están diseminando poblaciones resistentes y con ello definir cuán efectivas serán las campañas de control vectorial, si se mantienen de forma frecuente bajo los mismos esquemas.
En el presente estudio se concluye que las poblaciones de Ae. aegypti de Villa Elisa, sometidas a pruebas de susceptibilidad a deltametrina, evidenciaron alta resistencia, lo cual sugiere que deltametrina y otros piretroides no serían efectivos, en su totalidad, para el control de estos vectores. Estos resultados indican que es preciso contar con un sistema de monitoreo de resistencia de vectores a insecticidas, a fin de conocer la situación actual de las poblaciones de Ae. aegypti, sometidas a una alta presión de selección generada por el control químico. La eliminación de criaderos artificiales de las viviendas y del peridomicilio para evitar la presencia del vector y reducir la transmisión de agentes de enfermedades, debe ser siempre una medida simultánea en todo control vectorial.
