INTRODUÇÃO

Eugenia involucrata De Candolle é popularmente conhecida como Cerejeira, Cerejeira-do-mato, Cerejeira-da-terra, Cerejeira-do-rio-grande, dentre outros (^{Carvalho, 2008}). Pertence à família Myrtaceae, a qual é uma das famílias botânicas mais conhecidas pelo potencial biotecnológico das espécies nativas (^{Camlofski, 2008}). Essa espécie ocorre naturalmente em vários países da América do Sul, como Brasil, Argentina, Uruguai e Paraguai (^{Lorenzi, 2020}). Possui frutos que são altamente consumidos tanto na alimentação humana como na alimentação animal. Além disso, há potencialidade de usos de sua madeira na construção civil, na produção de ferramentas agrícolas e na produção de lenha e carvão, e suas árvores podem integrar projetos de recuperação de áreas degradadas e serem utilizadas no paisagismo e na arborização de áreas urbanas (Carvalho, 2008).

Diante do seu elevado potencial econômico, social e ambiental, justificam-se estudos relacionados à produção de mudas via propagação vegetativa, em particular a realizada por meio da cultura de tecidos, uma vez que a Eugenia involucrata possui sementes recalcitrantes, não suportando longos períodos de armazenamento (^{Carvalho, 2008}), o que compromete sua propagação pela via seminal. Na cultura de tecidos, é essencial o con trole da contaminação microbiana, pois o meio nutritivo proporciona um ambiente favorável para o crescimento de micro-organismos, como bactérias e fungos (^{Costa, Scherwinski-Pereira e Otoni, 2010}), sendo uma das principais causas de perdas de material vegetal.

A contaminação microbiana pode ocorrer em razão de uma desinfestação ineficiente ou inadequada do material vegetal, dos materiais utilizados e/ou do meio de cultivo. Porém, quando o surgimento destes micro-organismos não decorre destes erros, essa contaminação é denominada de endógena (^{Esposito-Polesi, Abreu-Tarazi, Almeida, Tsai e Almeida, 2017}).

Em Eugenia involucrata, particularmente, esse fato já foi evidenciado (^{Golle, Reiniger, Bellé e Curti, 2013}; ^{Gallon, 2017}; ^{Stefanel, Reiniger, Silva, Rabaiolli e Silva, 2020}), sendo registrada uma alta contaminação in vitro por bactérias endógenas nas culturas dessa espécie. O mesmo foi observado no cultivo in vitro de Eugenia uniflora (^{Lattuada, 2010}), Eucalyptus benthamii (^{Esposito-Polesi, Andrade, Almeida, Andreote e Almeida, 2015}), Psidium cattleianum (^{Freire, Gardin, Baratto, Vieira e Werner, 2018}) e Campomanesia xanthocarpa (^{Machado, Degenhardt, Maia e Quoirin, 2020}).

As bactérias endógenas, introduzidas sistemicamente com os explantes, impõem consideráveis limitações na fase de estabelecimento in vitro de plantas (^{Palú, Côrrea, Suzuki e Boliani, 2011}), ocasionando perda de tempo, de recursos financeiros e de material vegetal. Também, os agentes contaminantes podem competir com os explantes pelos nutrientes do meio de cultivo e liberar metabólitos tóxicos que podem ocasionar a morte das plantas (^{Pereira, Boliani e Furlani Júnior, 2014}). Do ponto de vista prático, a melhor solução consiste em realizar a autoclavagem e o subsequente descarte do material contaminado. Entretanto, quando existir o interesse na manutenção de determinados clones, torna-se necessário efetuar o controle dessas bactérias com o uso de antibióticos específicos (Pereira, Boliani e Furlani Júnior, 2014), os quais são adicionados aos meios de cultivo. Todavia, a maioria das bactérias endógenas são resistentes a alguns antibióticos por algum motivo desconhecido (^{Ramakrishna, Yadav e Li, 2019}).

Um dos antibióticos mais utilizados para o controle da contaminação bacteriana é o sulfato de estreptomicina. As estreptomicinas podem interferir na leitura correta do código genético, ocasionando a incorporação de aminoácidos diferentes, resultando, assim, em uma enzima inativa ou não-funcional (^{Kurylowicz, 1981}). Apesar da utilização de antibióticos ser de grande importância para o controle de bactérias endógenas, alguns antibióticos utilizados podem possuir ação bacteriostática, e não bactericida, sendo fitotóxicos para plantas (^{Grattapaglia e Machado, 1990}). Para se evitar problemas de toxicidade é necessário, portanto, testar a eficiência de seu modo de utilização, seja na imersão dos explantes em soluções contendo o(s) antibiótico(s), como na inoculação em meio nutritivo, além da pulverização das plantas matrizes usadas como doadoras de explantes (^{Pereira, Mattos e Fortes, 2003}).

Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do modo de utilização do antibiótico sulfato de estreptomicina no controle in vitro de bactérias endógenas em brotações de Eugenia involucrata.

MATERIAL E MÉTODOS

As brotações utilizadas para a realização do experimento, provieram de segmentos nodais estabelecidos in vitro, os quais foram previamente submetidos à desinfestação superficial durante 1 min em etanol a 70% (v/v), seguida da imersão durante 15 min em solução de hipoclorito de sódio (NaClO) a 2% (v/v), e, após 15 min, em solução de hipoclorito de cálcio (CaClO) a 2,5% (p/v). Na sequência, os segmentos nodais foram enxaguados três vezes com água destilada estéril. Os segmentos nodais desinfestados foram inoculados em meio MS (^{Murashige e Skoog, 1962}) com concentração de sais reduzida à metade (½MS), contendo 10 g L^-1 de sacarose, 50 mg L^-1 de mio-inositol, 4 g L^-1 de ágar e pH ajustado para 6,0, conforme metodologia de ^{Stefanel (2016}). O meio nutritivo, anteriormente à inoculação dos explantes, foi autoclavado a 121 °C e 1 atm de pressão durante 15 min. Após a inoculação em câmara de fluxo laminar, os frascos foram vedados com papel alumínio e mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2 °C, fotoperíodo de 16 h e intensidade luminosa de 20 μmol m^-2 s^-1, obtida a partir de lâmpadas fluorescentes brancas frias tipo luz do dia. Após 30 dias de cultivo in vitro, as brotações originadas foram utilizadas para a realização do presente experimento.

Os tratamentos foram constituídos da adição ou não do antibiótico sulfato de estreptomicina puríssimo (tratado como SE no texto) ao meio nutritivo ou da imersão dos explantes em solução contendo o antibiótico. Utilizaram-se segmentos apicais caulinares, com aproximadamente 1 cm de tamanho, que apresentavam ou não contaminação bacteriana prévia. Os tratamentos foram: T₁ (controle negativo) (explantes sem contaminação prévia); T₂ (controle negativo) (explantes com contaminação prévia); T₃ (explantes sem contaminação e imersos em solução de SE a 100 mg L^-1 durante 5 min); T₄ (explantes com contaminação e imersos em solução de SE a 100 mg L^-1 durante 5 min); T₅ (explantes sem contaminação e inoculados em meio contendo 100 mg L^-1 de SE); e T₆ (explantes com contaminação e inoculados em meio contendo 100 mg L^-1 de SE).

Conforme o tratamento, o antibiótico SE (esterilizado a frio) foi adicionado ao meio nutritivo após a autoclavagem do meio, quando foi atingida a temperatura ambiente, mas antes da sua solidificação. Todo o procedimento foi realizado em câmara de fluxo laminar.

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em arranjo unifatorial, composto por seis tratamentos e dez repetições, contendo três explantes cada uma. A unidade experimental foi composta por um frasco de vidro com capacidade para 150 mL, contendo 30 mL de meio nutritivo MS com concentração de sais reduzida à metade (½MS). Os frascos de vidro utilizados foram autoclavados antes da adição dos meios. Ao meio nutritivo ½MS foram acrescentados 30 g L^-1 de sacarose, 50 mg L^-1 de mio-inositol e 7 g L^-1 de ágar. O pH foi ajustado para 5,8, anteriormente à solidificação com ágar e, na sequência, o meio nutritivo e os frascos de vidro foram autoclavados a 121 ºC e 1 atm de pressão durante 15 min.

Após a inoculação, os frascos foram vedados com papel alumínio e mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 °C ± 2, fotoperíodo de 16 h e intensidade luminosa de 20 μmol m^-2 s^-1, obtida a partir de lâmpadas fluorescentes brancas frias tipo luz do dia. Aos 30 dias de cultivo in vitro avaliaram-se as variáveis: sobrevivência (indicada pela coloração verde do explante) (%), contaminação bacteriana (presença de colônias bacterianas junto aos explantes) (%), contaminação fúngica (presença de micélios fúngicos junto aos explantes) (%) e número de folhas por explante.

Após avaliar a normalidade dos dados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov e a homogeneidade de variâncias por meio do teste de Bartlett, as médias foram transformadas, pela função x+0,5 , sendo x o valor observado. As variáveis foram submetidas à análise de variância e, quando o valor de F foi significativo, foi utilizado, para a comparação das médias, o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade de erro. Foi utilizado o pacote estatístico Sisvar (Sistema para Análise de Variância) para Windows^® versão 5.1 (^{Ferreira, 2014}). Para determinar a precisão dos ensaios foi estimado o Índice de Variação (IV), calculado por 𝐶𝑉 √𝑁 , em que o IV é igual ao coeficiente de variação (CV) dividido pela raiz quadrada do número de repetições (N) (^{Pimentel-Gomes, 2009}).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a sobrevivência (média geral de 94,44%) e contaminação fúngica (média geral de 6,94%), não houve efeito significativo dos tratamentos. Houve efeito significativo para as variáveis contaminação bacteriana (p= 0,0002) e número de folhas por explante (p= 0,0150) (Tabela 1).

Foi observada uma alta sobrevivência dos explantes, indicando que o antibiótico nas condições e concentração testada (100 mg L^-1) não foi fitotóxico para as brotações de Eugenia involucrata. Também, não se observou a morte dos explantes cujas culturas apresentavam sinais de crescimento de colônias bacterianas no meio, sugerindo que as bactérias presentes são de natureza endógena e não fitopatogênicas. De maneira semelhante, no cultivo in vitro da Figueira (Ficus carica) houve aproximadamente 100% de sobrevivência dos explantes, indicando não haver efeito fitotóxico dos diferentes antibióticos testados e suas concentrações (^{Palú, Côrrea, Suzuki e Boliani, 2011}). Também, no cultivo in vitro de andiroba (Carapa guianensis), breu branco (Protium spruceanum) e pau-rosa (Aniba rosaeodora), foram obtidos índices muito elevados de sobrevivência com a utilização do antibiótico ampicilina a 500 mg L^-1 (^{Brandão, 2011}). Porém, no cultivo in vitro de Copaíba (Copaifera multijuga), não houve sobrevivência de nenhum explante quando submetidos aos tratamentos de desinfestação contendo os antibióticos ampicilina e cloranfenicol (isoladamente), ambos a 500 mg L^-1 (Brandão, 2011). Esses resultados distintos podem ser explicados pelo fato de que cada antibiótico gera um tipo de defesa, a qual depende da composição química e do modo como eles atuam sobre as bactérias (^{Santana, 2006}), sendo recomendado, portanto, a realização de experimentos avaliando diferentes tipos de antibióticos para cada espécie, a fim de se obter a máxima eficiência de descontaminação e elevada sobrevivência dos explantes.

Houve uma média geral relativamente baixa para a contaminação fúngica (6,94%), provavelmente devido aos explantes serem provenientes de subcultivo livre de contaminantes fúngicos. A contaminação fúngica observada pode ter sido ocasionada na manipulação para a transferência dos explantes para o meio fresco e/ou, também, por contaminantes presentes no próprio meio nutritivo. De maneira semelhante, em Ficus carica, a desinfestação superficial realizada nos explantes anteriormente à inoculação, a qual continha, dentre outros agentes, fungicida (methiltiofan) e antibiótico (cloranfenicol), resultou na ausência de contaminação fúngica nos cultivos (^{Palú, Suzuki e Boliani, 2011}). Contudo, em Copaifera multijuga, a utilização do fungicida derosal (5 mL L^-1) associado aos antibióticos cloranfenicol (500 mg L^-1) e ampicilina (500 mg L^-1), ocasionou uma média de até 86% de explantes contaminados por fungos (^{Brandão, 2011}). Apesar disso, há poucos relatos de trabalhos que confirmem o uso isolado de antibióticos para a redução da contaminação fúngica.

Para a variável contaminação bacteriana, o tratamento 1, o controle negativo de brotações que não estavam visivelmente com bactérias presentes, apresentou 33,33% de contaminação, enquanto que, no tratamento 2, o controle negativo de brotações que tinham contaminação bacteriana prévia, houve uma elevada contaminação (83,33%) (Tabela 1). No controle negativo com brotações que não apresentaram contaminação bacteriana prévia, e que foram apenas transferidas para o meio nutritivo fresco (tratamento 1), houve a proliferação desses micro-organismos. Uma significativa proliferação de bactérias no decorrer do cultivo tem sido frequentemente observada nos trabalhos realizados com essa espécie pelo nosso Grupo de Pesquisa, o que acaba comprometendo a continuidade dos experimentos. Isso também foi registrado no cultivo in vitro de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.), em que a desinfestação superficial realizada foi eficiente no controle de bactérias na fase de estabelecimento, porém, após alguns subcultivos, foi observada a proliferação de bactérias endógenas (^{Santos e Wendling, 2010}). No controle negativo com brotações que apresentaram contaminação bacteriana prévia, e que foram apenas transferidas para o meio nutritivo fresco (tratamento 2), houve uma elevada contaminação, muito provavelmente decorrente da proliferação bacteriana previamente existente. Isso sugere que não devem ser utilizados, em experimentos ou fases de micropropagação subsequentes, os explantes já contaminados na fase de estabelecimento, pois esses micro-organismos podem ser bastante nocivos, os quais impõe consideráveis limitações para os cultivos (^{Pereira, Boliani e Furlani Júnior, 2014}).

Nos tratamentos em que foram testadas a imersão de brotações sem e com contaminação bacteriana respectivamente (tratamento 3 e tratamento 4) (Tabela 1), observou-se, em ambos, uma contaminação de 100% dos explantes, indicando a ineficiência desse modo de utilização no controle de bactérias para a espécie. De maneira semelhante, em outro trabalho com Eugenia involucrata, ^{Gallon (2017}) obteve uma média elevada de contaminação submetendo os explantes à imersão em cloranfenicol (10 µL) indicando, também, a ineficiência deste método no controle das bactérias endógenas.

A imersão dos explantes em solução contendo antibióticos por um curto período de tempo, ao invés de sua adição ao meio nutritivo, é uma alternativa utilizada para evitar problemas com a fitotoxidade, porém pode comprometer a eficiência no controle da contaminação bacteriana (^{Lima e Moraes, 2006}), o que foi evidenciado no presente trabalho. O contrário, porém, foi observado no cultivo in vitro de Aniba rosaeodora, em que a menor porcentagem de contaminação bacteriana foi obtida pela imersão dos explantes durante 1 h em solução contendo 300 mg L^-1 de sulfato de estreptomicina (^{Handa, Sampaio e Quisen, 2005}); também, no cultivo in vitro de Carapa guianensis, cuja imersão dos explantes em solução contendo 500 mg L^-1 do antibiótico ampicilina proporcionou as menores médias de contaminação (^{Brandão, 2011}); e no cultivo in vitro de pitangueira (Eugenia uniflora), com a imersão dos explantes em solução contendo 200 mg L^-1 do antibiótico tetraciclina, cujo tratamento promoveu a ausência de contaminação bacteriana e fúngica (^{Lattuada, 2010}). Deve-se destacar, ainda, que ^{Gallon (2017}) obteve baixa porcentagem de contaminação em Eugenia involucrata testando a imersão dos explantes de origem seminal em solução contendo nanopartículas de prata (AgNps). Entretanto, a utilização desta técnica deve ser limitada, devido, dentre outros, a preocupações em relação a segurança ambiental, visto que, a liberação excessiva de prata no meio ambiente pode ser prejudicial ao homem e à fauna (^{Hajipour et al., 2012}), justificando, dessa forma, metodologias como a do presente estudo.

No tratamento em que as brotações sem contaminação bacteriana prévia foram inoculadas em meio nutritivo ½MS contendo 100 mg L^-1 do antibiótico SE (tratamento 5), foi observada a menor média de contaminação (16,67%) do experimento. Esse resultado indica uma maior eficiência desse modo de utilização, que consiste na adição do SE ao meio nutritivo em que os explantes não previamente contaminados são cultivados, do que naquele em que é realizado seu contato por imersão no antibiótico, por 5 min, antes do cultivo. De maneira semelhante, no cultivo in vitro de bananeira (Musa ‘Grande Naine’), a adição de 8 g L^-1 de agrimicina (cujos princípios ativos são o sulfato de estreptomicina e oxitetraciclina) ao meio MS, eliminou completamente a contaminação por bactérias nos explantes (^{Pereira, 2010}). Também, no cultivo in vitro de jabuticaba (Myrciaria jaboticaba), a inoculação dos explantes em meio nutritivo contendo 500 mg L^-1 de amoxicilina, promoveu a ausência de contaminação bacteriana e fúngica, entretanto, apesar de ter sido eficiente para o controle desses micro-organismos, a presença do antibiótico no meio foi prejudicial ao desenvolvimento dos explantes, ocasionado, provavelmente, pela fitotoxicidade da amoxicilina (^{Santos, 2017}).

Entretanto, na maioria dos experimentos, não é observada a eliminação total da contaminação in vitro, já que os tecidos vegetais podem servir como habitat para que esses micro-organismos se transloquem pelos seus tecidos (^{Pereira, Mattos e Fortes, 2003}). Esse fato foi constatado no presente trabalho e, também, em acácia negra (Acacia mearnsii), em que a adição de 2 mL L^-1 do antibiótico kasumin no meio nutritivo –MS, resultou na proliferação de bactérias em 100% dos explantes (^{Ishibashi, Koguta, Flôres Júnior e Higa, 2017}).

Apesar da menor contaminação evidenciada no tratamento 5, pode-se sugerir que o antibiótico SE teve um aparente efeito bacteriostático já que o mesmo tratamento em explantes previamente contaminados (tratamento 6) não obteve resultado satisfatório, como será discutido a seguir. O efeito bacteriostático observado é, somente, uma ação paliativa na contaminação in vitro, frente ao objetivo principal de eliminação total desses micro-organismos (^{Pereira, Mattos e Fortes, 2003}), portanto, recomenda-se a realização de novos experimentos com outros tipos de antibióticos e diferentes concentrações.

No tratamento em que se utilizaram brotações com contaminação prévia e cujo meio nutritivo continha SE (tratamento 6), foi observada uma média elevada de associação com bactérias. Esse resultado ratificou a observação de que não é adequada a utilização subsequente de explantes de Eugenia involucrata já contaminados e o possível efeito bacteriostático do antibiótico SE, relatado anteriormente.

Para a variável número de folhas observou-se que, no tratamento 5 (sem contaminação e com SE inoculado no meio), àquele de menor contaminação bacteriana (16,67%), os explantes formaram o maior número de folhas (3,83). Por outro lado, no tratamento 4 (com contaminação e imersão dos explantes em solução contendo SE), e em que 100% dos explantes foram contaminados após 30 dias de cultivo in vitro, não houve a formação de folhas, o que provavelmente foi ocasionado pela elevada contaminação bacteriana. Da mesma maneira, no cultivo in vitro de Lippia alba, os tratamentos que apresentaram menor contaminação formaram um maior número de folhas (^{Luz, Santos, Rodrigues, Blank e Asmar, 2014}). No cultivo de Myrciaria jaboticaba, porém, o maior número de folhas em plântulas foi obtido quando não se utilizou antibiótico no meio nutritivo (Santos, 2017).

Em todos os tratamentos que apresentaram médias elevadas de contaminação bacteriana, a formação de folhas foi prejudicada, evidenciando, mais uma vez, a necessidade de descarte de explantes e/ou frascos contaminados, haja vista a ineficiência de controle por meio da imersão em SE, independentemente de haver ou não contaminação prévia dos explantes, e, também, por meio da inoculação no meio daqueles já contaminados. Além disso, a não formação de folhas ocasionada pela contaminação bacteriana nos cultivos de Eugenia involucrata é prejudicial à sua multiplicação in vitro, visto que, na inserção entre o caule e a folha pode existir a formação de novas gemas, que irão originar brotos e, consequentemente, uma nova planta (^{Costa, Nepomuceno e Santana, 2010}).

CONCLUSÕES

A adição do antibiótico sulfato de estreptomicina no meio nutritivo na ausência de contaminação prévia controla a proliferação das colônias bacterianas, mas não é eficiente em reduzi-las quando os explantes estão contaminados. A imersão dos explantes em solução com antibiótico não controla a proliferação de bactérias, tanto na presença quanto na ausência de contaminação. O número de folhas é influenciado pela contaminação bacteriana dos explantes.