Obtención de cepas

Se utilizaron 8 cepas previamente aisladas de BAL: M6A, M6B, M16A, M17A, M17B, M18, M19 y M21 que posteriormente fueron depositadas al cepario del Departamento de Biotecnología de la FACEN-UNA. Como cepa control se utilizó Lactobacillus plantarum ATCC® 8014™.

Pruebas de actividad antimicrobiana Antibiogramas

Se plantearon tres pruebas de enfrentamiento bacteriano independientes, cultivando las BAL en distintos periodos de incubación y con distintos procesos de tratamiento del sobrenadante con el fin de obtener resultados óptimos en cuanto a la actividad inhibitoria ^{(Jabbari et al., 2017; Kormin} et al., 2001).

Procedimiento 1

Se procedió a la activación de las bacterias en estudio por 24 horas en MRSA a 37 °C en atmósfera aerobia. Pasado el periodo, se tomaron con un asa de siembra 5 µL de colonias provenientes de los cultivos, y se traspasaron a tubos que contenían 5 mL del MRSB, y se incubaron por 19 horas a 37

°C. Luego se tomaron 3 mL de los cultivos y se centrifugaron a 8290 g por 20 minutos a 4 °C. Se filtró el sobrenadante con filtros de 0,22 µm SFCA (Minisart, Sartorius), logrando así un sobrenadante libre de células. Posteriormente, se procedió a la realización de pocillos de 5 mm en placas con MHA y se agregó 10 µL de MHA en cada pocillo para cerrar el fondo del mismo y se dejó gelificar. Se colocaron 25 µL del sobrenadante libre de células en cada pocillo. Una vez colocadas las muestras se incubaron a 4 °C durante 2 horas para permitir que el sobrenadante se difundiera.

Se inocularon 100 µL cada una de las cepas patógenas de 24 horas de incubación en Agar LB, E. coli (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 25922™) y S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) y se realizó el hisopado por toda la placa creando un césped homogéneo. Posteriormente se incubaron a 37 °C por 18 horas en atmósfera de aerobiosis. Por último, se procedió al control de los resultados midiendo el halo de inhibición, con ayuda de una regla de vernier. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Procedimiento 2

Se realizó primeramente la activación de las bacterias en estudio por 24 horas en MRSA a 37 °C en atmósfera aerobia, pasado el periodo, tomando un asa de siembra de 5 µL de colonias provenientes de los cultivos y se traspasaron a tubos con 5 mL de MRSB, se incubaron por 93 horas a 37 °C; se tomaron 3 mL de los cultivos y se centrifugaron los 3 mL a 8290 g por 20 minutos a 4 °C. Se filtró el sobrenadante con filtros de 0,22 µm SFCA (Minisart, Sartorius), logrando así un sobrenadante libre de células. Posteriormente se procedió a la realización de pocillos de 5 mm en placas con MHA y se agregó 10 µL de MHA en cada pocillo para cerrar el fondo del mismo y se dejó gelificar. Se colocó 25 µL del sobrenadante libre de células en cada pocillo, una vez colocadas todas las muestras se incubaron a 4 °C durante 2 horas para permitir que el sobrenadante se difundiera.

Se inoculó 100 µL de cada una de las cepas patógenas de 24 horas de incubación en Agar LB, E. coli (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 25922™) y S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) y se realizó el hisopado por toda la placa creando un césped homogéneo. Posteriormente se incubaron a 37 °C por 18 horas en atmósfera de aerobiosis. Por último, se procedió al control de los resultados midiendo el halo de inhibición, con ayuda de una regla de vernier. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Procedimiento 3

Se realizó sin tratamiento previo del sobrenadante, dejando en el mismo todas las células bacterianas presentes; primeramente, activando las bacterias en estudio por 24 horas en MRSA a 37 °C en atmósfera aerobia, pasado el periodo, se tomó un asa de siembra de 5 µL de colonias provenientes de los cultivos y se traspasaron a tubos con 5 mL del MRSB, se incubaron por 24 horas a 37 °C. Se realizaron pocillos en placas con MHA y se agregó 10 µL de MHA en cada pocillo para cerrar el fondo del mismo y se dejó gelificar, se colocó 25 µL del cultivo no tratado en cada pocillo.

Se inoculó 100 µL de las cepas patógenas de 24 horas de incubación en Agar LB, E. coli (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 25922™) y S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) y se realizó el hisopado por toda la placa creando un césped homogéneo. Posteriormente se incubaron a 37 °C por 18 horas. Por último, se procedió al control de los resultados midiendo el halo de inhibición; todos los ensayos se realizaron por triplicado ^{(Kormin et al., 2001)}. En los tres procedimientos se utilizó la cepa Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. (ATCC® 8014™), como control positivo de potencial inhibidor frente a las bacterias patógenas humanas y como control negativo se utilizó suero fisiológico al 0,9% estéril.

Prueba en medio líquido

Preparación de sobrenadantes y patógeno

Se cultivaron las cepas de BAL en medio MRSB por 24 h a 37 °C y las cepas patógenas E. coli y S. aureus en medio LB por 24 hs a 37 °C, ambas en una incubadora de CO2 serie 3 water-jacketed (Thermo Scientific™), con una atmósfera de CO2 de 0,1%. Se centrifugaron los cultivo de los patógenos a 4500 rpm por 10 min a 10 °C en una centrífuga refrigerada TGL-16M (Boyn™), se desechó el sobrenadante y se re suspendió en PBS (1X). Se midió la absorbancia en el espectrofotómetro a 600 nm buscando llegar a una absorbancia de equivalente a 1,5×10⁷ UFC/mL.

BAL a 6000 g (7600 rpm) por 20 minutos a 4°C y se recuperaron los sobrenadantes. Luego se filtraron los sobrenadante con filtros de 0.22 μm (Sartorius) y se neutralizaron con hidróxido de sodio hasta un pH de 6~7 ^{(Gellert et al., 1999; Zimina et al., 2016)}.

Finalmente, se incubó en una placa multipocillo (×96) a 37 °C por 24 h en un Multiskan™ FC Microplate Photometer (Thermo Scientific™), acorde a los tratamientos presentados en la Tabla 1, y se midió la densidad óptica a 620 nm cada 30 min por espectrofotometría durante la incubación ^{(Gellert et al., 1999; Zimina et al., 2016)}. Cada tratamiento se realizó por cuadruplicado; como control positivo se utilizó se utilizó la cepa Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. (ATCC® 8014™) y como controles negativos se utilizaron: medio LB y agua estéril (Control 1) y medio MRSB y medio LB (Control 2), ambas inoculadas con 15 μL de L. monocytogenes (1,5×105 UFC/mL).

Cálculo del porcentaje de inhibición

Para el cálculo del porcentaje de inhibición se procedió a utilizar la absorbancia máxima del tratamiento y del control y se utilizó la siguiente fórmula:

Luego, se hicieron dos diluciones seriadas 1:10. Por otra parte, se centrifugaron los cultivos de

I = (Abs_t - Abs_c )/Abs_c * 100

Donde:

I = Porcentaje de inhibición.

Abst = Absorbancia máxima del tratamiento.

Absc = Absorbancia máxima del control.

Antibiogramas

En esta investigación se realizaron en total doce enfrentamientos, todos por triplicado, siguiendo las tres metodologías descritas en todos los casos. Aunque las BAL hayan tenido corto o largo periodo de incubación, los resultados arrojaron valores mínimos en cuanto a inhibición de las bacterias patógenas con las que fueron enfrentadas. Esto puede deberse a la falta de estrés de las BAL, las cuales para que liberen sus metabolitos secundarios deben tener un periodo de incubación prolongado o faltantes de nutrientes en su medio.

En todas las pruebas se detectaron zonas de inhibición mayores a 1 mm (Tablas 2-4). En la prueba del estudio de ^{Kormin et al. (2001)} se registró una sola zona de inhibición pequeña, indicando así un efecto inhibidor de crecimiento frente a otras cepas; una variable de importancia fue el control del pH en los ensayos, pues el mismo es un factor muy importante para la producción de agentes antimicrobianos de las BAL ^{(Biswas et al., 1991; Parente et al., 1994}), inhibiendo así el crecimiento bacteriano de cepas patógenas.

Procedimiento 1

Para el primer procedimiento se procedió según la metodología descrita en ^{Jabbari et al. (2017}), donde se enfrentaron 8 cepas de BAL aisladas y reactivadas por 19 horas. En el caso de E. coli solo se observó un halo de inhibición frente a M17B y en el caso de S. aureus se observó un halo de inhibición para todas las cepas estudiadas a excepción de M16A, los mayores halos corresponden a M17A (6,70 mm) y M17B (7,00 mm) (Tabla 2).

Procedimiento 2

En este procedimiento se cultivaron las 8 cepas de BAL aisladas por 93 horas frente a cepas patógenas alimentarias, se obtuvieron halos de inhibición en el caso de E. coli frente a M18 y M21, ambos de 2,00 mm y para S. aureus se observaron halos de inhibición frente a M16A, M18 y M19. Con este procedimiento no se obtuvieron halos frente al control positivo (Tabla 3), por lo que no es recomendable utilizar.

Procedimiento 3

En la tercera prueba de enfrentamiento la variable principal fue la no realización de los tratamientos previos de las células bacterianas posteriores a su incubación de 24 horas, las 8 cepas de BAL fueron aisladas y reactivadas por 24 horas y enfrentadas a cepas patógenas alimentarias; no se obtuvieron halos de inhibición en el caso del enfrentamiento con E. coli y en el caso de S. aureus se observaron halos frente a M6A, M17A, M18, M19, M21 y el control (Tabla 4). Los mayores halos de inhibición corresponden a M18 (4,33 mm) y M21 (4,00 mm). Usando como base el estudio de ^{Jabbari et al. (2017}), de 40 muestras de origen lácteo, se obtu vieron 11 BAL aisladas, y en el estudio de antagonismo de todas ellas frente a bacterias patógenas como son S. tiphy, S. aureus, S. epidermidis y E. coli frente a los aislados se obtuvieron valores más significativos, donde una de las variables es el periodo de incubación de las BAL en el proceso previo al enfrentamiento y la atmósfera modificada de oxígeno. En el estudio mencionado se utiliza- ron incubaciones de 48 y 72 horas, produciendo mayor estrés a las BAL; en cambio en las tres pruebas realizadas en este estudio, los periodos de incubación fueron sólo de 19, 24 y hasta 93 horas; sugiriendo que cuanto más estresadas se encuentran las BAL, mayor poder de inhibición tienen frente a patógenos.

Otros estudios demuestran que el efecto inhibidor de BAL frente a Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum y Clostridium perfringens, todas ellas reconocidas patógenas de origen alimentario, que son de aún mayor relevancia ya que son las de mayor incidencia y prevalencia en los estudios referidos a enfermedades de transmisión alimentaria.

Las pruebas referidas al enfrentamiento antagónico realizadas en el presente trabajo posibilitaron determinar cuáles BAL aisladas son posibles productoras de bacteriocinas y qué enfrentamientos realizar en nuevas pruebas.

Prueba en medio líquido

Se realizaron 3 repeticiones de cada ensayo para cada uno de los patógenos, cuyos resultados se observan en la Tabla 5.

Se observaron porcentajes de inhibición de hasta 99% en algunos casos. Sin embargo, se observa que existen diferencias en el porcentaje de inhibición entre repeticiones de algunos de los sobrenadantes analizados.