INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis es considerada una de las enfermedades tropicales más desatendidas en el mundo entero¹, y es transmitida por la picadura de hembras de flebótomos (comúnmente del género Lutzomyia: Psychodidae: Diptera) infectadas con el parásito del género Leishmania Ross, 1903². Existen varias especies de Leishmania, las cuales están presentes en casi todos los continentes con excepción de Oceanía³. Respecto a las manifestaciones patológicas, se pueden diferenciar tres tipos principales de leishmaniasis (leishmaniasis visceral, y leishmaniasis tegumentaria que se divide en leishmaniasis cutánea y leishmaniasis mucocutánea) y todas estas están presentes en Paraguay^4,5, y según los registros, la enfermedad ya lleva instalada en el país más de cien años⁶. La leishmaniasis cutánea (LC) es una infección crónica que muestra variación regional respecto al tipo de lesión dérmica producida por el parásito, aunque la más común es la úlcera moldurada ⁷.

La especie de Leishmania registrada en Paraguay como responsable de la LC es oficialmente L. (Viannia) braziliensis^4,5,8. Sin embargo, se registró un caso sospechoso causado por L. (V.) guyanensis ⁽⁹, y dos más recientes atribuidos a L. (Leishmania) infantumchagasi reconocidos mediante análisis moleculares con PCR¹⁰. La concentración más alta de casos de LC para Paraguay fue reportada en el este del país (Alto Paraná, Caaguazú, Canindeyú y San Pedro)⁵. El caso de LC causado por L. (L.) infantumchagasi fue registrado en la ciudad de Pedro Juan Caballero, limítrofe con Brasil, y el caso producido por L. (V.) guyanensis se reportó en el Departamento de San Pedro⁹.

En Paraguay, la vigilancia epidemiológica de leishmaniasis está a cargo del Programa Nacional de Control de la Leishmaniasis, dependiente del SENEPA (Servicio Nacional de Erradicación del Paludismo), perteneciente al MSPyBS (Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social). Como parte de la vigilancia nacional rutinaria, y empleando un protocolo de análisis molecular, aquí se reporta el primer registro de Leishmania (Viannia)lainsoni Silveira, Shaw, Braga & Ishikawa, 1987, la cual representa una especie adicional para el país

MATERIALES Y MÉTODOS

Caso clínico: Mujer de 27 años de edad, ama de casa, oriunda del Departamento de San Pedro (Figura 1). La paciente consultó en un servicio de atención médica (Hospital Regional de San Pedro), y fue posteriormente trasladada al SENEPA debido a la presencia de una lesión dérmica en el miembro inferior izquierdo, la cual inició dos meses antes como una pequeña pústula, con aumento gradual de tamaño y pérdida de sustancia. Algesia ocasional.

Figura 1: Distribución de Leishmania (Viannia)lainsoni (sombreado marrón) resaltando la localidad más al sur previamente conocida (punto rojo), y el nuevo registro para Paraguay (estrella negra) extendiendo aproximadamente 1,430 km al sur el rango de la especie. 

La paciente no presenta historia patológica relevante. La paciente declara no haber hecho traslados importantes ni locales ni internacionales.

El examen de la lesión, fue registrado como sigue: úlcera límpida con tejido granular y restos de fibra en la superficie, bordes moldurado eritematoso, levemente infiltrado, 8 cm de diámetro, localizada en el lado antero-externo de la región tibial izquierda. No se observan heridas mucosas.

Pruebas sanguíneas mostraron perfiles hepáticos y lipídicos dentro de los valores normales.

Análisis microscópico: Siguiendo una diagnosis clínica para LC, se tomaron algunas muestras de la herida para estudios parasitológicos. Un frotis de tejido de la herida (tomada de una profundidad de 3 mm) fue fijada en etanol 96%. La muestra fue coloreada con el método de tinción Wright-Giemsa (WGSM) en una concentración de dos gotas por ml de agua destilada y dos gotas de buffer PBS (Phosphate-buffered saline) (pH: 7.2), durante 30 min. Este análisis fue hecho en el Laboratorio de Bacteriología del “Hospital Nacional de Itauguá”.

Análisis moleculares: Tejido adicional fue extraído para análisis de ADN. Una muestra de tejido fue inmerso en 1 ml de xylol e incubado a 80-90 ºC por 5 min. Luego, la muestra fue centrifugada a 13000 rpm por 5 min, para eliminar el exceso de solvente. Este paso fue repetido dos veces. La muestra fue posteriormente inmersa en 1 ml de etanol 98% e incubada a temperatura ambiente por 5 min, y centrifugada a 13000 rpm por 5 min. Inmediatamente el tejido fue secado a 50 ºC y el ADN extraído y purificado usando el kit DNeasey® de Qiagen®.

Las reacciones de pre-amplificación fueron hechas usando el kit TopTaq Master Mix® de Qiagen® (el cual ya contiene dNTP’s), adicionando 0,2 μM de cada primer Forward (preamp_F: 5’ -GGC ATC CTG AAC GTG TCC G- 3’) y Reverse (preamp_R: 5’ -ATC TTG GTC ATG ATC GGG TTG CAT- 3’) para el gen de la proteína heat-shock 70 (hsp70) ¹¹, y 2,5 μl de ADN purificado de la muestra, alcanzando un volumen final de 25 μl. Cabe mencionar que los primers utilizados aquí fueron diseñados para aumentar la sensibilidad, y son empleados por primera vez en este trabajo. Las condiciones de PCR fueron como sigue: desnaturalización inicial 5 min (94°C) -[desnaturalización 30 sec (94°C) - hibridación 30 sec (55°C) - elongación 30 sec (72°C)] ×30. Para comparación, se incluyeron cepas de las siguientes especies de Leishmania como referencia: Leishmania (Leishmania) infantum, Leishmania (Leishmania)amazonensis, Leishmania (Leishmania)mexicana, Leishmania (Viannia)lainsoni, Leishmania (Viannia)braziliensis, Leishmania (Viannia)guyanensis, Leishmania (Viannia)naiffi y Leishmania (Viannia)shawi.

Análisis de PCR-RFLP fueron realizados usando 0,2 μl de los productos de la pre-amplificación, siguiendo el protocolo descrito por Graça et al.¹², generando una secuencia de 234 bp, el cual fue tratado con enzimas de restricción (BstU I, Hae III y Mbo I). Esto generó perfiles de electroforesis, los cuales permitieron la comparación con las cepas de referencia de Leishmania. El gel de electrophoresis fue hecho con agarosa 3% en buffer TAE buffer, y teñido con bromuro de etidio. La visualización fue hecha sobre transilluminator de luz UV, TFX-20M (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, USA) y fotografiado por un fotodocumentador LAB-020 (LabTrade do Brasil, Cotia, São Paulo, Brasil).

RESULTADOS

El examen visual del tejido bajo aumento de 100×, se observaron estructuras ovales de 2-4 μm, con un núcleo coloreado con tinción Wright-Giemsa; lo cual coincide con amastigotes de Leishmania sp.

El perfil de RFLP obtenido para la muestra de Paraguay en la electroforesis para BstU I mostró una banda compatible con L. (L.) infantum, L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana y L. (V.) lainsoni(Fig. 2A). Cuando comparado con las especies de referencia, usando Hae III enzima, la muestra paraguaya coincide con L. (V.) lainsoni y L. (V.) shawi(Fig. 2B). Finalmente, cuando la muestra fue tratada con la enzima Mbo I, las bandas generadas coinciden con la mayoría de las cepas, con excepción de L. (V.) guyanensis y L. (V.) shawi(Fig. 2C). Por lo tanto, la comparación integrada muestra que L. (V.) lainsoni fue la única especie que coincidió con la muestra de Paraguay en los tres casos. Además, con el análisis combinado de los tres perfiles probados fue posible excluir la compatibilidad con las restantes especies usadas como referencia.

Figura 2: Perfiles de PCR-RFLP para el gen hsp70 usando enzimas de restricción BstU I (A), Hae III (B) y Mbo I (C). “M” indica las bandas de referencia (100 bp), y la muestra objetivo está especificada con una “S”. Las cepas de las siguientes especies fueron usadas para comparación - Li: L. (L.) infantum, La: L. (L.) amazonensis, Lm: L. (L.) mexicana, Ll: L. (V.) lainsoni, Lb: L. (V.) braziliensis, Lg: L. (V.) guyanensis, Ln: L. (V.) naiffi y Ls: L. (V.) shawi. 

DISCUSIÓN

La correcta identificación de un parásito es un factor clave para la diagnosis de una enfermedad y el subsecuente tratamiento médico¹³. Sin embargo, la identificación visual y diferenciación de diferentes especies de Leishmania es, en la mayoría de los casos, una tarea imposible debido a similitudes morfológicas^14,15. En este contexto, el uso de herramientas moleculares aplicadas a la identificación parasitológica ayuda a interpretar la real diversidad de agentes infecciosos, y así dirigir correctas acciones ante los agentes patológicos. Sin embargo, hay que ser cautos. Más estudios son necesarios para conocer si Leishmania (Viannia) lainsoni es una especie autóctona en Paraguay, y aún más, el grado de dispersión de la especie.

Ahora, con la inclusion de L. (V.) lainsoni a la fauna de parásitos de Paraguay, surgen más preguntas, tales como: ¿Cuántos casos realmente existen causados por esta especie? ¿Cuál es la distribución de los casos debidos a esta especie en el país? ¿Son los vectores de esta especie en Paraguay los mismos que en otros países? Respecto a esta última pregunta, el vector más importante para esta especie, es el flebótomo Lutzomyia ubiquitalis en Brazil^16,17 y Lu. nuneztovarianglesi en Bolivia^18,19, los cuales nunca fueron registrados en Paraguay.

Adicionalmente, sería importante identificar reservorios naturales. En otras áreas de Sudamérica, al norte de la localización del caso descrito aquí, el mamífero Cuniculus paca (Cuniculidae: Rodentia) fue identificado como reservorio natural^20,21. Este roedor es abundante y de amplia distribución en Paraguay^21,22 y ciertamente también puede ser el reservorio natural para L. (V.) lainsoni en el país. Son necesarios estudios adicionales para confirmar la presencia de este parásito en C. paca u otros animales en la naturaleza.

Leishmania (V.) lainsoni fue registrada en los estados brasileros de Amapá, Pará y Rondônia^18,23 y regiones sub-andinas de Bolivia y Perú^17,25,26. Corrêa et al.¹⁹ ya mencionó que este parásito posee una amplia distribución en el neotrópico. Sin embargo, estudios posteriores mostraron que esta especie se distribuye principalmente por la región norte de Sudamérica alcanzando Ecuador, Surinam y la Guayana Francesa ²⁷, llegando parcialmente a Perú y Bolivia¹⁷ (Figura 1). Esta especie parece estar asociada a bosques tropicales húmedos con una vasta distribución en la Ecorregión de la Amazonía. En este trabajo se brinda información sobre su presencia en Paraguay y por lo tanto la distribución real de Leishmania (V.) lainsoni podría ser más amplia hacia el sur, extendiendo así su rango de distribución conocido en unos 1,430 km hacia el sur (Figura 1). El área donde el parásito fue encontrado en Paraguay corresponde a bosque templado húmedo, en el límite con el Chaco Húmedo. Un factor que hoy en día contribuye a la dispersión de las enfermedades son los fáciles medios para viajes de larga distancia, conducidos por el desarrollo de rutas de comunicación (fluviales, terrestres y aéreas).

El desarrollo de LC causada por L. (V.) lainsoni es básicamente el mismo que el observado por L. (Leishmania) amazonensis y L. (Viannia) braziliensis, y la diferencia más importante es que L. (V.) lainsonino produce lesiones dérmicas ulceradas y nodulares^17,28. Las lesiones de la piel del caso descrito aquí se ajustan con lo conocido para infecciones causadas por L. (V.) lainsoni. La evolución del caso no pudo continuarse debido a que la paciente volvió a su comunidad, sin Volver a tener contacto con el servicio asistencial.

Finalmente, es importante mencionar el valor de los estudios moleculares para la identificación taxonómica y su asociación con la severidad y características de la infección. Entonces, es altamente recomendable generar más análisis moleculares combinados con la vigilancia centinela normal en Paraguay, para apuntar a resolver algunas de las preguntas que surgieron en este estudio. En este sentido, el caso reportado aquí proviene de una zona endémica, comúnmente atribuida a L. (V.) braziliensis. Un mejor conocimiento de los agentes y riesgos de la leishmaniasis en Paraguay, ayudará a disminuir significativamente el número de casos en el país, o proveer una mejor asistencia a la población afectada.