INTRODUCCIÓN

El principal vector transmisor en la Enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi en la Región del Cono Sur de América Latina, es el Triatoma infestans. El fenómeno básico de la transmisión vectorial del T. cruzi al hombre y la adaptación de los triatominos al ecotopo doméstico, más precisamente su domiciliación, dependen de factores tales como su grado de antropofilia, disponibilidad de alimento y condiciones de la vivienda. La transmisión vectorial se lleva a cabo principalmente a través de vectores estrictamente domiciliados^1-2. Esta vía de transmisión ha disminuido en la última década, gracias a las decisiones políticas de los países que con actividades sostenidas de control vectorial han logrado el corte de la transmisión intradomiciliar de T. cruzi por esta especie³. En Paraguay, se ha logrado la interrupción de la transmisión vectorial intradomiciliar por T. infestans en el año 2018 en las regiones Oriental y Occidental del país y se encuentran desde esa fecha bajo vigilancia entomológica⁴. A partir de los avances obtenidos en la eliminación y control de la transmisión vectorial domiciliaria de T. cruzi, se observan cambios en la dinámica de transmisión que propician la emergencia de otros escenarios entomológicos, tales como la ocurrencia de ciclos peridomésticos o silvestres que involucran a especies autóctonas³. Muchas especies nativas adquieren importancia epidemiológica debido a la capacidad de intercambio entre hábitats selváticos y domésticos, así como para reemplazar el nicho ecológico de triatominos domiciliarios². Por esta razón es importante considerar la presencia de especies nativas de focos selváticos como: T. sordida, T. guasayana, P. megistus y otros en el proceso de colonización de las viviendas humanas y que son clasificadas como potenciales vectores de la enfermedad. Existen reportes de nuestro grupo de trabajo sobre la capacidad vectorial de la especie secundaria T. sordida provenientes de áreas endémicas de las dos regiones del Paraguay donde se describió una elevada colonización e infección natural en esta especie secundaria. En un estudio con ejemplares de T. sordida capturados entre el 2005 y el 2007 en el departamento de Concepción (Región Oriental), la colonización intradomiciliar detectada fue del 44% con una infección natural del 11%⁵; mientras que en el Chaco Paraguayo (Región Occidental) en un estudio con ejemplares de T. sordida capturados entre el 2013 y el 2015, se ha estimado un 87% de riesgo de transmisión de T. cruzi intradomiciliar⁶. En otro estudio con T. sordida de la misma región publicado en el 2018, donde se analizaron 220 ejemplares, se detectó infección natural con T. cruzi en un 17,3%⁷. Estos resultados evidencian la capacidad adaptativa de esta especie al domicilio, y un incremento de su potencial vectorial para transmitir la enfermedad de Chagas en áreas del país. Este estudio se realizó con el fin de evaluar el potencial riesgo de transmisión de la enfermedad de Chagas por especies secundarias de triatominos capturados en etapa de vigilancia entomológica en áreas endémicas de las dos regiones del país.

MATERIALES y METODOS

Área de estudio y población: Se analizaron un total de 759 ejemplares de triatominos de especies secundarias (T. sordida, T. gusayana, T. guasu y P. geniculatus), de los departamentos de Concepción, Paraguarí, Cordillera y San Pedro de la Región Oriental y los departamentos de Boquerón, Pte. Hayes y Alto Paraguay de la región Occidental. En la Tabla 1 se puede observar el número de triatominos por vivienda y por departamento como así también la especie. Los ejemplares fueron capturados en etapa de vigilancia entomológica por funcionarios del SENEPA entre el 2010 y el 2016, fueron clasificados taxonómicamente según Lent y Wygodzinsky⁸ y analizados por microscopía óptica (MO) para la detección de T. cruzi en heces en el laboratorio de Entomología del SENEPA (MSP y BS). Todos fueron negativos para T. cruzi por MO.

Tabla 1.  Población de estudio. Número de triatominos capturados, especies, número de viviendas infestadas, procedencia por dpto. 

Elaboración de base de datos, obtención de información epidemiológica: Los ejemplares estaban agrupados en bolsas individuales, de acuerdo con las viviendas de donde fueron capturados, cada bolsa contenía una ficha con datos registrados por funcionarios del SENEPA, donde se anotaron los datos entomológicos como: lugar de captura (intra/peri), departamento, localidad, estadío (ninfa/adulto) y especie, como así también el resultado de infección natural con T. cruzi por MO. Con estos registros se elaboró una base de datos en formato Excel para la obtención de información epidemiológica.

Disección de Triatominos: Se realizó la disección de cada ejemplar para obtener las heces del triatomino, colocándose cada muestra en microtubos de 1.5 ml, con 500 ul de solución tampón (10mM Tris, pH 7.4, 1mM EDTA, 150 mM NaCl y 1% SDS). Las muestras se llevaron a ebullición por 15 minutos y posterior a eso se realizó una centrifugación a 8000 rpm por 5 minutos, luego se guardaron a -20°C hasta el momento de la extracción.

Extracción de ADN: En casos de viviendas donde se capturó un solo ejemplar, se tomsron 300 ul del sobrenadante resultante del proceso de disección y se colocaron en un nuevo tubo de 1,5 ml para empezar la extracción. En el caso de las viviendas donde se capturaron más de un insecto adulto, para la extracción se prepararon pooles, tomando un volumen del sobrenadante de cada tubo preparado inicialmente con cada ejemplar hasta completar un volumen final de 300 ul. Este mismo procedimiento se realizó con las ninfas provenientes de una misma vivienda. Cada tubo fue incubado con 10 ul de proteinasa K (20ug/Ml) a 60°C por 1 hora. Luego se inactivó la enzima por calentamiento a 95°C por 10 minutos (9-10). El ADN fue extraído aplicando el método Fenol-Cloroformo, para precipitar el ADN se colocaron 500ul de etanol puro, glucógeno (20ug) y acetato de sodio 3M pH 5,4 en un 10% del volumen recuperado. El ADN obtenido se resuspendió en 100ul de H₂O bidestilada estéril ⁽⁹.

Cuantificación de ADN: Se prepararon diluciones 1/20 del ADN resuspendido para la cuantificación de ADN en el espectrofotómetro Bioware DNA (WPA, UK) obteniéndose la concentración de ADN en ng/ul y la pureza según la relación de absorbancia a 260/280. Las muestras que no tenían una relación 260/280 igual o superior a 1, fueron re-precipitadas y sí aun así no alcanzaban una pureza aceptable, se sometieron a una re-extracción con PCI (Fenol: Cloroformo: Alcohol Isoamílico) y Fenol, posterior precipitación y resuspensión del ADN. En caso de no obtener la lectura esperada después de estos procedimientos, se repetía la extracción con una nueva alícuota del resuspendido inicial conservado a -20⁰C.

Infección natural con T. cruzi: La identificación especie específica de T. cruzi se realizó por el método PCR empleando como blanco las secuencias repetitivas de ADN nuclear (microsatélites) de T. cruzi, con los cebadores TCZ1 y TCZ2 descrito por Moser et al. ⁽¹¹ y ADN kinetoplastídico con cebadores 121 y 122 descrito por Degrave et al. y Russomando et al. Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo un transiluminador UV.

RESULTADOS

Elaboración de la base de datos: Se elaboró una base de datos con los registros proveídos por el Departamento de Entomología del SENEPA, correspondiente a cada vivienda donde fueron capturados los triatominos en etapa de vigilancia entomológica. Del análisis de la base de datos se obtuvo información epidemiológica sobre la especie de triatomino capturado, el estadío (ninfa/adulto), el sitio de captura (intradomiciliar o peridomiciliar), la procedencia y el número de viviendas infestadas por departamento. Se analizó un total de 759 ejemplares procedentes de los departamentos Concepción, Paraguarí, Cordillera y San Pedro, de la Región Oriental y los departamentos de Boquerón, Pdte. Hayes y Alto Paraguay de la Región Occidental. En el dpto. de Concepción se capturó un total de 638 triatominos de la especie T. sordida, de los cuales 43 ejemplares fueron capturados en el intradomicilio y 595 ejemplares en el peridomicilio, de los capturados en el intradomicilio, 8 eran ninfas y 35 eran adultos, de los capturados en el peridomicilio 289 ejemplares eran ninfas y 306 eran adultos. Las viviendas infestadas fueron en total 240. Del Departamento de Paraguarí se analizaron 4 ejemplares, 2 de la especie P. geniculatus, 1 de la especie T. guasu y 1 de la especie T. guasayana, de los 4 ejemplares, 2 fueron capturados en el intradomicilio y 2 en el peridomicilio, todos eran adultos. Las viviendas infestadas fueron 2. En el dpto. de Cordillera se capturaron 3 ejemplares adultos; 2 de la especie T. guazu y 1 de la especie P. geniculatus. 2 ejemplares fueron capturados en el intradomicilio y 1 ejemplar en el peridomicilio, Las viviendas infestadas fueron 3. En el dpto. de San Pedro se capturó en una vivienda un ejemplar adulto de la especie T. guasayana en el intradomicilio. En el Dpto. de Boquerón se capturaron 14 ejemplares; 13 de la especie T. guasayana y 1 de la especie P. geniculatus, 2 ejemplares correspondientes al intradomicilio y 12 al peridomicilio. Las viviendas infestadas fueron 14. En el dpto. de Pte. Hayes se capturaron 94 ejemplares, 5 de la especie T. guasayana y 89 de la especie T. sordida, 9 ejemplares eran del intradomicilio y 80 del peridomicilio, las viviendas infestadas fueron 26. En el dpto. de Alto Paraguay se capturaron 5 ejemplares de 5 viviendas, 2 de la especie T. guasayana y 3 de la especie T. sordida, todos del peridomicilio. Estos resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2.  Distribución de los triatominos capturados por departamento según especies, estadío (ninfas o adultos), lugar de captura (intradomicilio/peridomicilio) y número de viviendas infestadas. 

Detección de T. cruzi por la técnica PCR con cebadores especie-específicos.

Detección de infección natural con T. cruzi en los triatominos analizados:

De 759 ejemplares analizados (140 pooles; promedio de 4 ejemplares por vivienda y 200 muestras individuales), se logró detectar infección natural con T. cruzi en 17 ejemplares, de los cuales, 12 triatominos fueron capturados en el peridomicilio: especie T. sórdida (11) y T. guasayana (1) y los 5 ejemplares infectados en el domicilio corresponden a adultos de las especies: T. sordida (2), P. geniculatus (2) y T. guasayana (1). No se capturaron ninfas infectadas naturalmente en el domicilio. Ver Tabla 3.

En la Figura 1 se pueden observar tanto los productos obtenidos con controles positivos (cepas de referencia) y su equivalencia en cantidad de parásitos, como así también los productos de amplificación de los ejemplares T. cruzi positivos con bandas de 198 pb obtenidos con los cebadores TCZ1 y TCZ2 y 330 pb obtenidos con los cebadores 121 y 122.

Figura 1.  Productos de amplificación por PCR de cepas de referencia de T. cruzi y muestras de triatominos con cebadores TCZ1/TCZ2 y 121/122. Carriles 1 al 6, reacciones de PCR con cebadores TCZ1/TCZ2 y productos de 198 pb y carriles 8 al 13, productos amplificados con cebadores 121,122 con tamaño de 330 pb. Carril 1 y 2: Control positivo (cepa de referencia X₁₀Cl₁) 10 y 100 parásitos respectivamente e intensidad de banda equivalente. Carril 3,4: muestras de triatominos con infección natural con T. cruzi. Carril 5: muestra de triatomino sin infección natural con T. cruzi. Carril 6: control negativo de reacción (agua). Carril 7: marcador de peso molecular de 100 pb. Carriles 8 y 9 corresponden a controles positivos (cepas de referencia X₁₀Cl₁), 100 y 10 parásitos respectivamente. Carriles 10, 11 y 12: correspondientes a ejemplares de triatominos infectados con T. cruzi con intensidades de bandas fuertes. Carril 13: control negativo de reacción (agua). 

Tabla 3. Infección natural con T. cruzi detectada en 17 ejemplares de especies secundarias por sitio de captura y estadío. 

DISCUSIÓN

Un total de 759 ejemplares de triatominos, de las especies T. sordida, T. guasayana, T. guasu, y P. geniculatus fueron incluidos en este estudio, todos capturados en el domicilio y/o peridomicilio. En Paraguay, según datos publicados por el SENEPA, se han registrado hasta la fecha la circulación de 8 especies de triatominos; entre las que se encuentran: T. infestans, T. sordida, T. guasu, T. guasayana, P. geniculatus, P. megistus, Triatoma platensis y Rhodnius sp. Entre ellas, el T. infestans y el T. sordida se destacan por su importancia epidemiológica ⁴. Los 759 ejemplares de triatominos que han sido incluidos en este estudio fueron capturados en fase de vigilancia entomológica en 7 departamentos: Concepción (T. sordida), San Pedro (T. guasayana), Cordillera (P. geniculatus y T. guasu), Paraguarí (P. geniculatus, T. guasayana y T. guasu), Alto Paraguay (T. guasayana y T. sordida), Pte Hayes (T. guasayana y T. sordida) y Boquerón (T. guasayana). Tan solo 17 triatominos (2,2%) de los 759 ejemplares analizados con cebadores especie específico arrojaron positividad para infección natural con T. cruzi, de los cuales la mayoría fueron de la especie T. sordida, 13/17 (76,4%) 10 capturados en el Departamento de Concepción y 3 en el Departamento de Pte. Hayes. Este resultado resalta una vez más la importancia del vector T. sordida como un vector secundario en Paraguay para la enfermedad de Chagas ⁽¹⁰. Al analizar los hallazgos en el Departamento de Concepción, cabe resaltar que 638 de los 759 (84%) triatominos totales de este estudio eran ejemplares de T. sordida del citado departamento, sé observó que 43 ejemplares (8 ninfas y 35 adultos) fueron capturados en el intradomicilio de los cuales resultó positivo 1 ejemplar adulto, además de registrarse nuevamente colonización intradomiciliar de esta especie. El ejemplar adulto en el domicilio pone en evidencia el riesgo de ingreso continuo de especies secundarias. Los otros 9 ejemplares positivos eran del peridomicilio, de los cuales 8 eran adultos infectados y una ninfa infectada. En Pte. Hayes también T. sordida fue la especie mayoritaria 89 (94,7%) del total de 94 ejemplares capturados, encontrándose 3 ejemplares con infección natural, uno de ellos adulto intradomiciliar y 2 de ellos en el peridomicilio (1 adulto y 1 ninfa). Estos hallazgos resaltan la problemática del peridomicilio con animales mamíferos pequeños infectados con T. cruzi que facilitan la capacidad vectorial de T. sordida al invadir y colonizar las viviendas. Sin embargo, si se analiza que tan solo 9 (1,4%) de los 638 ejemplares de T. sordida evaluados del Departamento de Concepción y 3 (3,4%) de los 89 ejemplares de T. sordida evaluados del Departamento de Pte. Hayes resultaron infectados naturalmente con T. cruzi resulta un porcentaje de infección mucho menor en comparación con trabajos anteriores publicados por nuestro grupo de trabajo donde se había reportado hasta un 10,6 % de infección natural con T. cruzi en dicha especie en el Departamento de Concepción y 17,3% en el Chaco Paraguayo (5-7). En el año 2020, se reportaron infecciones naturales de la especie T. sordida en Paraguarí, Cordillera y San Pedro del 19%, 44% y 20% respectivamente ¹². En los Departamento de Pte. Hayes y Boquerón, se capturaron 5 y 14 ejemplares de la especie T. guasayana, respectivamente. En la Región Occidental o Chaco, la especie T. guasayana debería ser monitoreada, al detectar infección natural con T. cruzi en un ejemplar adulto capturado dentro del domicilio en Boquerón y un ejemplar adulto con T. cruzi en el peridomicilio en Pte. Hayes. En los Departamentos de Paraguarí y Cordillera, los triatominos adultos capturados dentro del domicilio de la especie P. geniculatus estaban infectados naturalmente con T. cruzi¹². Cabe destacar que estas muestras son de especies selváticas, en nuestro país no hay mucho reporte de infección de estos vectores diferentes a T. sordida. Existen pocos trabajos en el país que reportan infección natural con T. cruzi en triatominos de especies selváticas, y que invaden el domicilio. En un trabajo realizado en huésped y reservorios del Gran Chaco se reportó infección en un ejemplar de T. guasayana¹³. La presencia de especies nativas de focos selváticos generalmente se da ya que el nicho ecológico de los mismos es invadido y destruido, como consecuencia de las urbanizaciones. Es importante considerar la presencia de especies nativas de focos selváticos en proceso de colonización en la vivienda ya que las mismas son clasificadas como vectores potenciales para la transmisión de la enfermedad ². Como conclusión de este trabajo se resalta que la presencia de triatominos de especies secundarias detectadas dentro del domicilio de las viviendas y la infección natural de los mismos podría ser un indicador de la búsqueda de adaptación a las viviendas y el intento de ocupar el lugar del vector principal. Estos hallazgos ponen en evidencia que existe un potencial riesgo de transmisión de T. cruzi por estas especies de triatominos por lo que la presencia de estos vectores en las viviendas en etapa de vigilancia entomológica obliga a replantear o reforzar el proceso de vigilancia.