INTRODUCCIÓN

El agua es un recurso natural básico para la supervivencia de los seres vivos. Sin embargo, es vehículo para la transmisión de una amplia variedad de patógenos. Más de 2,5 millones de personas mueren por año por enfermedades asociadas a aguas contaminadas y condiciones sanitarias precarias, mayormente en países en desarrollo^1,2. La calidad de la sanidad del agua es determinada usualmente por la concentración de coliformes fecales indicadoras y ocasionalmente por bacteriófagos^3,4. Sin embargo, existen numerosos estudios que demuestran que el alcance de los estándares mínimos de coliformes fecales no predice la contaminación viral y la presencia de otras especies patógenas bacterianas en el agua^3,5.

Las inundaciones son eventos hidrometereológicos extremos que constituyen uno de los factores climáticos que promueven la aparición de epidemias. Los cambios en los patrones de precipitación están aumentando en frecuencia e intensidad debido al cambio climático^6-8, como consecuencia, se produce el aumento en la ocurrencia y en la magnitud de los eventos de inundación extrema, que son reconocidos como el tipo de desastre natural más frecuente y devastador en el mundo⁹. Estas aguas de inundación pueden irrumpir en los desagües y en la infraestructura de abastecimiento de agua¹⁰ causando la exposición de los pobladores a efectos inmediatos como: hospitalizaciones, efectos psicológicos, daños fisiológicos e incluso mortalidad^11,12 así como contacto directo con el agua contaminada o a los cortes y abrasiones, promoviendo el surgimiento de brotes de una amplia gama de enfermedades infecciosas^12-16.

Una de las causas de brotes de enfermedades infecciosas por contaminación de agua o alimentos son los virus. Entre ellos se encuentran virus causantes de gastroenteritis como: rotavirus (RV), adenovirus (AdV), astrovirus (AstV), norovirus (NoV) y sapovirus (SaV)^17-19. Estos se transmiten vía fecal - oral, son altamente infecciosos y son excretados en las heces en altas concentraciones (10⁵-10¹¹ partículas virales/gramo) durante un periodo prolongado, que puede llegar a periodos mayores de 28 días^2,17. Por ello, pasan fácilmente al sistema de alcantarillado, donde son altamente estables y mantienen su infectividad incluso luego de ser expuestos a procesos de desinfección, resultando en la contaminación potencial de cauces hídricos si no se posee un sistema de saneamiento adecuado^18-20.

Los RV, familia Reoviridae, son la mayor causa de gastroenteritis infantil en todo el mundo. La mortalidad asociada a estos virus está estimada en aproximadamente 600.000 por año²¹. Se clasifican de forma binaria según sus genes VP4 (P[X]) y VP7 (GX) y poseen una enorme variabilidad genética^22,23. En nuestro país se ha reportado su circulación con una diferencia en la distribución temporal de RV entre niños y adultos, produciendo en los primeros un pico de incidencia en los meses más fríos del año²⁴.

La familia Caliciviridae incluye a los NoV y SaV y son reconocidos como la causa más importante de brotes y epidemias de gastroenteritis no bacteriana en todos los grupos de edad, que ocurren principalmente como resultado de contaminación de alimentos y agua. Los más prevalentes son los NoV, que están distribuidos en 5 genogrupos (GI-GV) de los cuales GI, GII y GIV infectan humanos y en 32 genotipos que co-circulan y con los que se ha observado, ocurre recombinación^25-27. En Paraguay, se han reportado la presencia y epidemiología molecular de NoVs en casos de gastroenteritis aguda (GEA) infantil no bacteriana. Se ha demostrado la circulación y alta prevalencia de cepas pandémicas del genotipo GII.4 así como la alta prevalencia de genotipos poco comunes emergentes²⁸.

Los AstV, familia Astroviridae, son virus de genoma de ARN, se han detectado en heces de niños, pero también se han encontrado en las heces de una amplia variedad de especies de mamíferos, así como en especies de aves de corral y aves acuáticas silvestres^29,30. Según la ICTV, están reconocidas 19 especies dentro del género MAstV y 3 especies dentro del género AAstV^29,31.

AdV pertenece a la familia Adenoviridae y se divide en 5 géneros. Mastadenovirus es el género específicamente asociado a infecciones y enfermedades en huéspedes mamíferos³². Más de 60 tipos de adenovirus humanos han sido reportados clasificándolos en 7 grupos (A-G). Los serotipos entéricos que se asocian sobre todo con la gastroenteritis son HAdV-40 y HAdV-41 que pertenecen a las especies F, otras especies tales como A, C, y D también se han asociado con la diarrea^33,34.

Las micobacterias no tuberculosas (MNT) son responsables de una amplia gama de patologías, principalmente infecciones en heridas en los ojos, oídos, nariz, garganta u otras infecciones generalizadas en el cuerpo y son de importancia para la salud pública³⁵. La mayoría de las MNT presenta resistencia a gran parte de las drogas empleadas en el tratamiento de M. tuberculosis^36-38. Además, poseen alta resistencia a los procesos clásicos de desinfección, especialmente al clorado^39,40.

Durante los meses de junio a agosto del 2014 la ciudad de Asunción, Paraguay, así como varios municipios del país, sufrió precipitaciones extremas que causaron el colapso del sistema de alcantarillado y de contención de los cursos de agua (ríos y arroyos), ocasionando una de las más graves inundaciones en la historia de la ciudad⁴¹. La Dirección de Meteorología e Hidrología de la Dirección Nacional de Aeronáutica Civil (DINAC) registró un nivel histórico de las aguas del río Paraguay a 7,38 metros de profundidad el 10 de julio del 2014⁴². Estos eventos dejaron como resultado un número elevado de damnificados. Según el Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF), alrededor de 245.000 personas debieron ser desplazadas a refugios temporales o campamentos provisionales en zonas altas de la ciudad, de las cuales, aproximadamente 180.000 eran menores de edad. Con esto, hubo un aumento de los problemas de salud y seguridad entre los afectados⁴³.

El Departamento de Biología Molecular y Biotecnología (DBMB) del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de Asunción (IICS-UNA) ha sido pionero en la introducción de técnicas moleculares aplicadas para la identificación y caracterización de micobacterias, como también la identificación y caracterización en genotipos de RV y NoV^24,28,44,45.

Por lo anteriormente expuesto y teniendo en cuenta que estos agentes patógenos no pueden ser detectados por técnicas laboratoriales convencionales y que para su detección se requiere el examen de grandes volúmenes de muestra, se implementó una técnica de concentración de micobacterias y agentes víricos en muestras de agua para su posterior detección y caracterización por técnicas moleculares⁴⁶.

Este trabajo presenta la identificación por técnicas moleculares de micobacterias y agentes víricos que causan brotes epidémicos transmitidos por el agua, en muestras obtenidas de las inundaciones producidas en Asunción, Paraguay, durante el periodo de junio a agosto del 2014, así como datos secundarios de los servicios de salud de barrios afectados, referentes a casos de enfermedades infecciosas registrados en la quincena del evento de inundación.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Las colectas fueron realizadas en dos jornadas distintas comprendidas del 17 al 22 de julio del 2014, que fueron seleccionadas debido a la baja probabilidad de lluvia (10%) pronosticada para la región para esas fechas. Las temperaturas medias ambientales fueron de 22°C y 28°C, respectivamente, con cielo parcialmente nublado y clima poco ventoso. La posición geográfica de los puntos de colecta pueden ser observados en la Figura 1 y en la Tabla 1 se resumen las características de las muestras colectadas.

Figura 1: Registro geográfico de los puntos de colecta. SAJ1 y SAJ2 corresponden a los puntos de toma de muestra del Barrio Sajonia, SAN1 y SAN2 a los del Barrio San Jerónimo, SANA1 y SANA2 a los del Barrio Santa Ana, CHACA1 y CHACA2 a los del Barrio Ricardo Brugada - Chacarita. 

Tabla 1: Información de las muestras colectadas.  

Los parámetros físico-químicos de las muestras se listan en la Tabla 2 y se puede observar que la temperatura de las aguas no superó los 25°C, con una media de 23°C. La mayor variación con respecto a la temperatura ambiental se dio en las muestras CHACA 1 y CHACA 2, donde las aguas se encontraban once y seis grados centígrados más frías. Todas las aguas colectadas presentaron un pH levemente ácido en el momento de la colecta.

La conductividad eléctrica es una medida de capacidad para conducir la electricidad, está relacionada con el contenido de sales disueltas y su típica conversión al cloruro de sodio disuelto se realiza suponiendo que 1 μS/cm es equivalente a cerca de 0,6 mg de NaCl por kg de agua⁵⁹. En nuestro estudio, la conductividad varió entre un máximo de 495 μS/cm en la muestra tomada en zona urbana del barrio San Jerónimo (SAN-2) y un mínimo de 125,8 μS/cm en la muestra de agua del Río Paraguay tomada en Sajonia (SAJ-1). Realizando la conversión, se estima una concentración de 297 mg y 75,48 mg de NaCl por kg de agua, respectivamente. El agua pura no es un buen conductor de la electricidad (5,5 μS/m), debido a que la corriente eléctrica es transportada por los iones en solución, la conductividad eléctrica aumenta a medida que la concentración iónica se incrementa⁵⁹. Siendo que el agua potable típica está en el rango de 5-50 mS/m (50 - 500 μS/cm), se puede inferir que todas las aguas colectadas se encuentran con una conductividad eléctrica similar a la del agua potable (Tabla 2).

La salinidad es el contenido de sales minerales disueltas en un cuerpo de agua, este contenido de cloruro de sodio (NaCl) es el que le da sabor y debido a eso a las aguas con bajo contenido se las denomina “agua dulce”. La salinidad del agua varía según la intensidad de la evaporación, es por eso las aguas superficiales son más saladas, y es más intensa en las zonas tropicales y menor en las zonas polares. El porcentaje medio de NaCl que existe en los océanos es de 3,5%, o sea 35 g/L de agua y el contenido de sal en agua potable es, por definición, menor a 0,05 % (< 0,5 g/L ó 500 mg/L). El agua es señalada como salobre a una concentración de NaCl de 0,5 - 30 g/L, o definida como salina si contiene de 3 a 5 % (3-5 g/L) de sal en volumen⁵⁹. Las muestras de agua obtenidas de las inundaciones presentaron un valor máximo de 280 mg/L (SAN-2) y mínimo de 72,9 mg/L (SAJ-1). Considerando estas informaciones, las podemos calificar como de agua dulce, debido a que presentan valores de concentración de NaCl similares a los del agua potable (Tabla 2).

El total de sólidos disueltos (TDS, del inglés: Total DissolvedSolids) es una medida del contenido combinado de todas las sustancias inorgánicas y orgánicas contenidas en un líquido en forma molecular, ionizada o en forma de suspensión micro-granular (sol coloide)⁵⁹. El contenido total de sólidos disueltos de las muestras colectadas en este estudio encontró un máximo de 350 mg/L (SAN-2) y un mínimo de 90,3 mg/L (SAJ-1). Estos datos, sumado al alto contenido microbiano registrado en todas las muestras colectadas, a través de la medición de coliformes totales y fecales, permitieron realizar la caracterización de las aguas, que presentaron mayoritariamente características de aguas de clase II y III, de una elevada carga microbiana y una extrema baja cantidad de OD propia de ambientes muy poluidos y con elevada contaminación orgánica (Tabla 2).

Tabla 2: Parámetros físico-químicos de las muestras colectadas. La temperatura es medida en grados Celsius (ºC), la conductividad es medida en micro Siemens (μS), los sólidos disueltos totales (TDS) y salinidad se miden en partes por millón (ppm) ó mg / L. Sd= sin datos. 

Tabla 3: Lista de cebadores y sondas utilizados en la detección de genes virales. 

Figura 2: Registro fotográfico de los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el gen (822 bp) de la polimerasa viral de los norovirus (NoV). Gel de agarosa 2%-TAE, teñido con bromuro de etidio. Carril 1: marcador de peso molecular 100 pb.; carriles 2 al 9: SAJ-1, SAJ-2, SAN 1, SAN 2, SANA 1, SANA 2, CHACA 1 y CHACA 2, respectivamente; carril 10: control positivo NoV, carril 11: control negativo de floculación, carriles 12 al 14: controles negativos PCR. Flechas lisa y de puntos indican los productos de aproximadamente 822 pb. y 550 pb. 

Figura 3: Registro fotográfico de los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para el gen (310 bp) de la polimerasa viral de los norovirus (NoV). Gel de agarosa 2%-TAE, teñido con bromuro de etidio. Carril 1: marcador de peso molecular 100 pb; carriles 2 al 5 y 8 al 11: SAJ-1, SAJ-2, SAN 1, SAN 2; y SANA 1, SANA 2, CHACA 1 y CHACA 2, respectivamente; carriles 6 y 12: controles positivos NoV de floculación; carriles 7 y 13: controles negativos de floculación; carriles 14 y 15: controles positivo y negativo de la PCR anillada. 

Tabla 4: Resultados de la detección de rotavirus (RV), norovirus (NoV) y micobacterias no tuberculosas (MNT) en las muestras de agua analizadas, por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR anidada y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). RdRp= gen que codifica la RNA polimerasa dependiente de RNA. GII= Genogrupo II. Los resultados negativos son indicados con un menos (-) y los positivos con un más (+).  

Figura 4:  Registro fotográfico de los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el gen hsp65 con cebadores M1 y M4. Gel de agarosa 2%-TAE, teñido con bromuro de etidio. A. Carril 1: marcador de peso molecular de 100 pb; carril 2: control negativo de reacción; carriles 3 y 4: SAN-1 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 5 y 6: SAN-2 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 7 y 8: SAJ-1 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 9 y 10: SAJ-2 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 11 y 12: controles negativos de filtrado; carril 13: control negativo de extracción de ADN; carril 14: control positivo y carril 20 marcador de peso molecular de 50pb. B. Carril 1: marcador de peso molecular de 100 pb; carril 2: control negativo de reacción; carriles 3 y 4: SANA-1 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 5 y 6: SANA-2 filtros de 0,7 y 0,45µm; carriles 7 y 8: CHACA-1 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 9 y 10: CHACA-2 filtros de 0,7 y 0,45 µm; carriles 11 y 12: controles negativos de filtrado; carril 13: control negativo de extracción de ADN; carril 14: control positivo y carril 20 marcador de peso molecular de 50pb.  

Tabla 5: Resultados de la detección de rotavirus (RV), norovirus (NoV), adenovirus entérico (AdV) y astrovirus (AstV) en las muestras de agua analizadas, por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en Tiempo Real (Fast-TrackDiagnostics). Los resultados negativos son indicados con un menos (-) y los positivos con un más (+). Ct= Cycle Threshold (Ciclo umbral de detección); CP= control positivo; CN= control negativo. 

En la BAR se revisaron 2.881 registros, de estos cumplían con la definición de casos operativa 46 pacientes cuya tasa de ataque fue de 1,6%.

Figura 5: Curva epidémica de los casos, según fecha de consulta, Asunción, 2014. N=46. 

El mayor número de casos ocurrió en el barrio Ricardo Brugada (Chacarita). En la primera semana de estudio se registró la mayor cantidad de casos de GEA. El sexo femenino predominó, el promedio de edad fue de 16 años con un rango de 3 meses a 83 años, el síntoma de mayor manifestación fue la diarrea seguido de fiebre.

DISCUSIÓN

En este estudio se analizó la presencia de RV, NoV, AstV, AdV entérico y MNT en aguas superficiales provenientes de zonas afectadas por las inundaciones producidas durante los meses de junio a agosto del año 2014 la ciudad de Asunción, Paraguay; y se presentan, además, resultados del análisis de casos de diarrea, fiebre y dolor abdominal registrados en los centros de salud más cercanos a los puntos de colecta, como datos epidemiológicos de interés.

Con respecto a la detección viral de RV por métodos clásicos de biología molecular, no se observó el patrón electroforético característico de los 11 genes del rotavirus en la electroforesis en gel de poliacrilamida. En la reacción en cadena de la polimerasa para el gen conservado que codifica para la NSP5 de los RV, no se produjo la amplificación del segmento de gen característico de 1000 pb. aproximadamente. Sin embargo, en la RT-PCR para el gen conservado que codifica para la RdRp de los calicivirus se produjo la amplificación parcial del gen y se observó una banda de aproximadamente 550 bp., diferente a la banda de 822 bp. característica de la reacción en la muestra SAN-1. A pesar de esto, no se produjo la amplificación del fragmento interno a éste, en la PCR anidada, dado que no se observó la banda de 310 pb. característica de la reacción. Esto pudo haberse debido a sustancias inhibitorias de la reacción de la polimerasa presentes en la muestra o a los propios límites de detección de la técnica.

A pesar que los protocolos moleculares, a diferencia de métodos tradicionales basados en el cultivo, no distinguen entre organismos viables y no viables, la PCR convencional es una técnica altamente específica y muy sensible para la detección de patógenos en muestras ambientales; especialmente, considerando que la técnica de cultivo celular aplicada a la detección de algunos virus es inviable o muy compleja⁶⁰.

En el estudio de muestras ambientales, sin embargo, es necesaria la aplicación de metodologías de concentración, debido a que en muchos ambientes la cantidad de partículas virales es muy baja o se encuentran muy diluidas en el cuerpo de agua, como es el caso de las aguas de inundación(⁴⁶⁾. La PCR en Tiempo real ha presentado sensibilidad incluso mayor, en mucho casos, a la del método de cultivo bacteriano o que el ensayo de placa viral, se ha consolidado rápidamente en el estudio de matrices ambientales⁶¹. Además, la PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR), que utiliza ARN como molécula molde, se basa en la amplificación de un segmento del genoma utilizando colorantes o sondas fluorescentes para su detección, lo que conduce a una mayor especificidad y sensibilidad.

Para aumentar la sensibilidad de la metodología y poder realizar una mejor detección viral en las muestras analizadas, se realizó la RT-PCR en Tiempo Real utilizando un Kit de reacción comercial específico para la amplificación de genes de rotavirus del grupo A, norovirusgeno grupo I y II, astrovirus y adenovirus entérico (Fast-track Diagnostics, Luxemburgo). Esta metodología permitió confirmar la detección específica de norovirus de los genogrupos I y II en la muestra SAN-1, además de permitir la amplificación genética de adenovirus entérico humano (Ct=21), no detectado en la muestra por la RT-PCR convencional. Con respecto a las demás muestras, se logró la detección de rotavirus grupo A en la muestra SAN-1 (Ct=34); astrovirus y adenovirus entérico humano en las muestras SAJ-2 con Ct= 31 y Ct=21, respectivamente; y SAN-2 con Ct= 29 y Ct= 24, respectivamente. Estos resultados indican que la metodología de RT-PCR en Tiempo Real, con la previa aplicación de una metodología de concentración viral, resulta ideal y elemental para la detección viral en aguas superficiales de inundaciones, con respecto a las metodologías convencionales de biología molecular.

Teniendo en cuenta resultados anteriores obtenidos en nuestro laboratorio, para la detección de micobacterias, se realizó el macerado de los filtros previo a la extracción por el método orgánico con CTAB^55,56;y no por métodos químicos buscando una mayor recuperación del material genético, para posteriormente someterlo a PCR de una región del gen hsp65, observándose amplificación con los cebadores externos M1 y M4 de ADN micobacteriano en las muestras colectadas en San Jerónimo tanto en SAN-1 región de viviendas donde existía agua estancada producto de la inundación, sobre la calle San Agustín esq. Estela Maris, como en SAN-2 agua superficial colectada del curso del canal “Arroyo Jaén” y en Sajonia la muestra SAJ-2 zona de viviendas donde existía agua estancada producto de la inundación de la calle Capitán Bozzano.

Mientras que con los cebadores internos Tb 11 y Tb 12 a las muestras citadas anteriormente se adiciona la amplificación en la muestra CHACA- 1 de la zona de viviendas de la calle Mompox esq. Zayas del barrio de la Chacharita donde también existía agua estancada producto de la inundación. La amplificación se dio en el ADN extraído a partir de la membrana de 0,45 µm que es la de menor porosidad por lo que posee mayor retención que en el filtro de 0,7 µm, logrando de este modo aumentar la sensibilidad de la técnica aplicando la PCR anidada. Cabe resaltar que con los cebadores Tb11 y Tb12 se logra amplificar un fragmento del gen hsp65 presente en todas las especies micobacterianas descriptas hasta la fecha y que mediante cortes con enzimas de restricción se podrían identificar a más de 140 especies micobacterianas⁶².

Si bien la mayoría de las micobacterias ambientales puede crecer en un medio mínimo de sales en casi la misma tasa en la que crecen en M7H9 o M7H10, algunas especies de micobacterias ambientales pueden requerir una fuente exógena de ácidos grasos para el crecimiento. El cultivo de los filtros en medio liquido podría utilizarse para individualizar las colonias micobacterianas, sin embargo, en trabajos anteriores se describe que se debe tener mucho cuidado a la hora de la elección del medio de cultivo debido que se podría estar inhibiendo el crecimiento de alguna de las especies dependiendo de los componentes que contengan los diferentes medios que podrían ser utilizados^62,63.

Con respecto a los datos epidemiológicos registrados en los servicios de salud seleccionados, se encontró una baja incidencia en el número de casos de GEA; si bien la resolución de problemas de urgencia en atención primaria ha mejorado considerablemente, hay que precisar que los medios que disponen varias USF para resolver estos problemas urgentes son limitados por lo que muchos de los pacientes deciden acudir a servicios de mayor complejidad, se presume que la baja incidencia observada podría verse aumentada si se revisan los registros de los hospitales de mediana o alta complejidad del área^64,65.

De entre los casos, los niños menores de 5 años fueron los más afectados lo que coincide con el reporte de la OMS donde se menciona que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de muerte de niños menores de cinco años⁶⁶.

Varios estudios reportan la aparición de brotes de enfermedades infecciosas en periodos posteriores a eventos climáticos adversos, especialmente de lluvia pesada e inundaciones, seguido de sequías^67,68. En las regiones tropicales y subtropicales incluso las enfermedades endémicas y transmitidas por alimentos como la hepatitis han generado brotes debido a la exposición al agua contaminada y la inundación, tanto en países en desarrollo como en regiones desarrollada^67,68. En este contexto, el sistema de manejo de aguas residuales y alcantarillado público cobra extrema importancia, dado que su desbordamiento durante eventos de precipitación extrema a menudo podría presentar riesgos de propagación de patógenos en las áreas y comunidades afectadas. En nuestro estudio se reporta la existencia de situaciones similares en las muestras SAJ-2, SAN-1 y SAN-2, relativas a entornos urbanos de barrio con alcantarillado desbordado y aguas residuales expuestas. Si bien existió la limitación de acceso a muestras de eventos de gastroenteritis o enfermedades asociadas a MNTs en pobladores de la zona; se ha registrado una susceptibilidad intrínseca en la exposición a eventos de inundación, especialmente en poblaciones ribereñas, usualmente en situación de pobreza (Ricardo Brugada - Chacarita) y que las personas más afectadas son niños menores a 5 años de edad (41%, 19/46).

En conclusión, en este trabajo se rescatan datos del análisis de las muestras colectadas en los periodos de inundación debido a las precipitaciones intensas que sufrió la ciudad de Asunción de junio a agosto del 2014 y reportamos la presencia y circulación de agentes infecciosos en los sitios de colecta, tanto MNTs como virus de gastroenteritis humana, de diversos tipos y genogrupos: rotavirus, norovirus (genogrupos I y II), astrovirus, adenovirus entéricos. Además, se evaluaron las metodologías para la detección concluyendo que la PCR en tiempo real y la PCR-asociada al análisis de restricción enzimática (PRA), aplicadas luego de metodologías de concentración, son elementales y poseen buena sensibilidad para la detección de los agentes infecciosos estudiados. Estas metodologías tienen amplia aplicación ya que pueden ser utilizadas para la vigilancia ambiental de agentes infecciosos de interés para la salud humana.