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INTRODUCCIÓN
La emergencia de Enterobacterales productoras de carbapenemasas constituye un enorme desafío para la salud pública, por el incremento en la morbi-mortalidad y los altos costos que generan el manejo y control de sus infecciones1.
Las principales carbapenemasas en este grupo bacteriano son: KPC (clase A), NDM, IMP, VIM (clase B) y OXA-48 (clase D)2; todas ellas de amplia distribución a nivel mundial, y endémicas en varios países de la región y el mundo.
En nuestro país, desde la confirmación de la carbapenemasa KPC en el año 2009 3,4 y la metalobetalactamasa NDM en el 20125, varios centros asistenciales del país han reportado su circulación; sin embargo, hasta la fecha no ha sido reportada la doble producción de carbapenemasas en Enterobacterales6-8.
A fin de conocer acerca de la circulación de los gérmenes resistentes a los antimicrobianos y el genotipo de las enzimas involucradas, es fundamental el trabajo multidisciplinario que llevan a cabo los equipos de salud en la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos (RAM).
El Laboratorio Central de Salud Pública (LCSP), a través del Departamento de Bacteriología y Micología, coordina la Red Nacional de Vigilancia laboratorial de la Resistencia a los Antimicrobianos (RNVRAM) desde hace más de 20 años, trabajando de manera conjunta con los laboratorios públicos y privados de todo el país, en la caracterización molecular de las carbapenemasas circulantes.
Este año, los centros que conforman la RNVRAM han reportado incremento en el número de aislamiento de cepas de Enterobacterales resistentes a los carbapenemes, lo que motivó la puesta a punto de la técnica de PCR convencional múltiple para la detección simultanea de varios genes de carbapenemasas en este grupo bacteriano; los resultados de la implementación de la técnica confirmaron la circulación de Enterobacterales dobles productores de carbapenemasas en hospitales del país; constituyendo la comunicación de estos hallazgos el principal objetivo de la presente publicación.
MATERIALES Y MÉTODO
Estudio retrospectivo de corte transversal realizado con aislamientos de Enterobacterales provenientes de 20 centros colaboradores de la RNVRAM de Capital, Central e interior del país; remitidos al LCSP entre febrero y setiembre de 2021, para la confirmación de portación de carbapenemasas, y su genotipificación.
Los criterios de derivación de las cepas fueron:
Halo de inhibición de imipenem ≤ 22 mm, o
Concentración inhibitoria mínima (CIM) en equipo automatizado (Vitek2 C®) de imipenem ≥ 2 ug/mL9.
Fueron estudiados un total de 128 aislamientos remitidos, los cuales fueron sometidos a pruebas bioquímicas manuales para confirmación de especies bacterianas; tamizaje fenotípico de producción de carbapenemasas y estudios genotípicos para la detección de genes de resistencia a los carbepenemes.
Tamizaje fenotípico para detección de producción de carbapenemasas: Fue realizada por la prueba colorimétrica rápida blue carba10 y las pruebas de sinergias entre los discos de carbapenemes con los de ácido fenilborónico (APB) y ácido etilendiaminotetraacético/ácido mercaptoacético de sodio (EDTA/SMA). Además, de las pruebas de sinergia entre los discos de ceftazidima-avibactam (CZA, 14 ug) y EDTA (15 mm de distancia de centro a centro); y, entre los de aztreonam (AZT, 30 ug) y APB (10 mm de distancia de centro a centro).
Estudio genotípico para la detección de genes de resistencia: Realizado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple de punto final, utilizando cebadores específicos para la detección simultánea de los genes bla KPC, bla NDM, bla IMP, bla VIM y bla OXA-48-like11.
Para la obtención del ADN, se utilizó el método de lisis bacteriana por ebullición durante 10 minutos de una suspensión bacteriana de aproximadamente 0,5 Mac Farland en 300 uL de agua libre de RNAsa y centrifugada posteriormente a 10.000 rpm por 10 minutos Las reacciones de amplificación de los genes se realizaron en un termociclador TC-PRO (BOECO Germany) y los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% en tampón TAE buffer (PanReac AppliChem - ITW Reagents). Las imágenes de los patrones electroforéticos fueron obtenidas con el equipo fotodocumentador Gel DocTM EZ Imager (BIO-RAD) y analizadas con el programa Image Lab 6.0 (BIO-RAD).
RESULTADOS
De los 128 aislamientos de Enterobacterales, 107 correspondieron a Klebsiella pneumoniae, 14 a Enterobacter cloacae complex, 2 a Escherichia coli, 2 a Citrobacter freundii, y 1 a Klebsiella oxytoca, Klebsiella aerogenes y Providencia stuartii. Los mismos fueron recuperados en mayor frecuencia de muestras de orina (30%), respiratorias (30%), sangre y catéter (24%), secreciones (13%), entre otras; de pacientes mayoritariamente hospitalizados (96%).
Los genes de resistencia a los carbapenemes detectados fueron:
bla NDM en 99 aislamientos (77,3%), siendo predominante la especie bacteriana K. pneumoniae (88%), seguida por E. cloacae complex (6%);
bla KPC en 22 aislamientos (17,2%), prevalente en K. pneumoniae (64%), seguida por E. cloacae complex (32%);
bla NDM + bla KPC en 6 aislamientos, todos ellos de K. pneumoniae; y,
bla NDM + bla OXA-48-like en 1 aislamiento de E. cloacae complex.
De los 7 aislamientos dobles productores de carbapenemasas (5,5%); 6 fueron provenientes de cuatro centros diferentes de la capital de país y uno de Central. Todas las cepas coproductoras de KPC+NDM correspondieron a K. pneumoniae, sin embargo, la coproducción de NDM + OXA-48-like fue confirmada en un aislamiento de E. cloacae complex. La Tabla 1 resume los resultados de caracterización molecular de las cepas estudiadas.
Tabla 1. Genotipificación de Enterobacterales productores de carbapenemasas por PCR convencional múltiple. Febrero a setiembre de 2021.Paraguay. N: 128.
Fuente: Dpto. Bacteriología y Micología, Laboratorio Central de Salud Pública. MSPyBS. Paraguay.
En cuanto a las características de los aislamientos con doble producción de carbapenemasas y sus orígenes; en el 100 % fueron recuperados de muestras clínicas tomadas de pacientes hospitalizados con más de 25 días de internación. La Tabla 2 resume las características más importantes proveídas por los centros remitentes.
Tabla 2. Características de los aislamientos dobles productores de carbapenemasas. Paraguay. Año 2021.
Fuente: Dpto. Bacteriología y Micología, Laboratorio Central de Salud Pública. MSPyBS. Paraguay.
Los resultados de los estudios fenotípicos de las cepas dobles productoras de carbapenemasas fueron:
K. pneumoniae (6):
- Blue carba test: Positivo
- Sinergia entre disco de CZA (14 ug) y disco de EDTA: Positivo.
- Sinergia entre discos de AZT (30 ug) - discos de APB: Positivo.
E. cloacae complex (1):
- Blue carba test: Positivo
- Sinergia entre disco de CZA (14 ug) y disco de EDTA: Positivo.
- Sinergia entre disco de AZT (30 ug) y disco de APB: Negativo.
La Figura 1 muestra los resultados de sinergias de las cepas de K. pneumoniae dobles productoras de carbapenemasas; y la Figura 2 muestra los resultados de caracterización molecular llevadas a cabo por PCR convencional múltiple de las cepas estudiadas con los respetivos controles de calidad.
CONCLUSIÓN Y DISCUSIÓN
Este es el primer reporte en el país de detección en Enterobacterales con doble producción de carbapenemasas, con portación de genes bla NDM + bla KPC en aislamientos de K. pneumoniae; y de genes bla NDM + bla OXA-48-like en E. cloacae complex. Hasta la fecha, solo hemos confirmado las producciones de carbapenemasas KPC y NDM en Enterobacterales, siendo éste el primer hallazgo de OXA-48; una enzima ya descrita en países de la región (Argentina, Brasil y Colombia) 12-14, y una de las más frecuentes en países de Europa15,16.
Los primeros hallazgos de coproducción de carbapenemasas en Enterobacterales fueron confirmados en cepas provenientes de la India: Karthikeyan K y colaboradores informaron en el año 2010 el primer reporte de coexistencia de OXA-48 y NDM-117, y en el año 2012, Kumarasamy y colaboradores publicaron la coproducción de NDM-1 y KPC-2 en aislamiento de K. pneumoniae recuperado de una muestra de orina en julio de 201018. A partir de entonces, varios países del mundo han confirmado hallazgos similares de coproducción de diferentes genotipos19-21.
En países de la región, los primeros en reportar coproducción de carbapenemasas fueron investigadores de Brasil: Nava RG y colaboradores en el 2019 22; y, Oliveira EM y colaboradores en el 202023, describiendo la portación de genes bla NDM + bla KPC en aislamientos de K. pneumoniae.
En abril del 2021 el Laboratorio de Referencia Regional “Dr. Carlos Malbrán”. INEI. ANLIS, emitió una Alerta Epidemiológica: Emergencia de dobles productores de carbapenemasa KPC+MBL”, en la que se describe la confirmación en la primera ola de la pandemia por COVID-19 la emergencia y diseminación de colonización/infección de Enterobacterales productores de combinaciones de carbapenemasas en la Argentina, de los genotipos KPC+NDM, NDM+OXA-163 y NDM+IMP 24.
A raíz de los reportes regionales, el Laboratorio de Referencia Nacional llevó a cabo la estandarización de metodologías (fenotípicas y genotípicas) y estudios retrospectivos en los aislamientos productores de carbapenemasas, y los resultados de los hallazgos fueron socializados en un comunicado en setiembre del presente año, con las recomendaciones para los laboratorios de microbiología 25. La alerta epidemiológica regional por producción de dobles carbapenemasas fue emitida por la Organización Panamericana de la Salud el 22 de octubre 26 y la alerta epidemiológica nacional por el Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social el 2 de noviembre de 2021 27.
Esta emergencia y diseminación de bacterias coproductoras de carbapenemasas, requiere una respuesta firme, coordinada y protocolizada por parte de todo el equipo sanitario multidisciplinario y autoridades de salud humana, veterinaria y ambiental, que permitan el control precoz y minimice su impacto negativo.
Nuestros hallazgos además obligan a proveer capacidades de detección a los laboratorios de bacteriología de todo el país, de manera a que se puedan tomar medidas oportunas y eficaces de contención y control.
