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INTRODUCCIÓN
La familia Flaviviridae comprende aproximadamente 60 especies de virus diferentes, y se encuentra conformada por varios géneros, de los cuales, 53 especies corresponden al género Flavivirus, entre ellos, los de mayor importancia en la salud pública son los virus dengue (DENV), encefalitis de San Luis (SLEV), fiebre amarilla (YFV), Nilo Occidental (WNV) y Zika (ZIKV)1. Los flavivirus se transmiten a través de mosquitos o garrapatas, e incluyen agentes patógenos para los seres humanos y los animales2. Son responsables de provocar una considerable morbilidad y mortalidad en humanos; llevando a causar desde infecciones febriles leves a graves como encefalitis, síndromes hemorrágicos y hepatitis3,4. Los flavivirus también pueden ser virus específicos de insectos (ISFV), que no pueden infectar a vertebrados. Los ISFV constituyen un desafío para la mejor comprensión del ciclo de transmisión de los virus transmitidos por artrópodos, arbovirus5.
Los flavivirus de importancia médica requieren de tres actores esenciales para establecer y mantener un ciclo de transmisión: el virus, el artrópodo, y los vertebrados. Como requisito previo para la circulación continua del virus entre el vector artrópodo y hospedador vertebrado, todos los factores deben estar disponibles en número suficiente, al mismo tiempo y en el mismo lugar6.
Uno de los aspectos más importantes para el control de las enfermedades transmitidas por arbovirus es la disponibilidad de sistemas de detección sensibles, específicos que permitan determinar el nivel de actividad viral para, de este modo, diseñar, desarrollar y aplicar sistemas de vigilancia eficaces, así como sistemas de diagnóstico de infección en humanos y animales que permitan la toma de medidas adecuadas para minimizar los efectos de la infección7.
Los flavivirus de impacto sanitario para nuestra región incluyen al DENV que provoca una variedad de síntomas desde sin signos de alarma hasta dengue grave, el YFV productor de enfermedad febril con hemorragias e ictericia y el ZIKV. También en la región han sido detectados otros flavivirus, tales como SLEV, WNV y virus Ilheus (ILHV)8-12.
En el Paraguay, los flavivirus reportados son DENV, YFV y ZIKV. El dengue es endémico en el país donde han sido detectados casos clínicos desde 1988 y ha causado grandes epidemias a lo largo de los años. Mientras que de ZIKV se han reportado casos confirmados desde el 2015. Estos flavivirus se encuentran circulando simultáneamente desde el 2015 hasta la actualidad. Por otro lado, en nuestro país también fue detectada la circulación del YFV, observándose en el año 2008, 24 casos confirmados de infecciones con 8 muertes13.
Tanto el DENV, ZIKV y YFV son trasmitidos por mosquitos del género Aedes (aegypti, albopictus, polynesiensis y scutelaris), siendo en Paraguay, el principal vector el Aedes aegypti, especie doméstica que se desarrolla en una amplia variedad de criaderos14,15. Aún no existen reportes de circulación de otros flavivirus en nuestro país.
Paraguay constituye un sitio que reúne las condiciones apropiadas para permitir la circulación de numerosos flavivirus que aún no han sido reportados pero que circulan de manera autóctona en países limítrofes como Brasil y Argentina. Datos no publicados proporcionados por el Departamento de Entomología del Servicio Nacional de Erradicación del Paludismo (SENEPA) describieron una gran variedad de especies de mosquitos, aproximadamente 90 especies como Culex quinquefasciatus, Culex pipiens, Culex nigripalpus, entre otros. Los mismos podrían actuar como vectores de estas virosis16.
Existen varias técnicas moleculares (RT-PCR) que permiten la detección del RNA de los flavivirus con alta sensibilidad y especificidad, las cuales pueden utilizar primers universales genéricos para regiones como NS5 que pueden detectar presencia de infección por cualquier flavivirus o primers específicos para detección de infección por DENV, YFV, entre otros17-20.
En un estudio previo realizado en Paraguay en el 2017, se estandarizó una técnica descripta previamente por Sánchez-Seco de RT-nested PCR genérica para detección de flavivirus que utiliza oligonucleóticos específicos para el gen NS5 que es una región homóloga que codifica la polimerasa, una de las proteínas mejor preservadas en virus de RNA, permitiendo por ello esta técnica amplificar una gran variedad de virus de RNA dentro de este género18,21. Este estudio fue realizado en sueros de individuos con sospecha clínica de dengue, obteniéndose una buena sensibilidad de 0,2 UFP para detección de estos virus, sin embargo, localmente aún no fue utilizada en la detección de flavivirus en mosquitos21.
Por ello, el objetivo de este estudio fue la implementación de un sistema de detección de flavivirus en mosquitos colectados en zonas urbanas y rurales de Paraguay entre los años 2016 a 2018. Dentro de este sistema se utilizará un RT-nested PCR previamente descripta por Sánchez-Seco et al., 2005 que permitirá la detección género específica a bajo costo, de patógenos de importancia a nivel de salud pública y además permitirá detectar ISFV; cuya investigación, podría contribuir a mejorar la comprensión sobre el ciclo de transmisión de estas virosis18.
MATERIALES Y MÉTODOS
Capacitaciones realizadas
Para la implementación de técnicas de detección de flavivirus en mosquitos se realizaron capacitaciones previas con profesionales expertos del Instituto de Virología J.M. Vanella de la Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Las capacitaciones consistieron en clases teóricas y prácticas y pasantías de los miembros del equipo de trabajo del IICS-UNA, que fueron llevadas a cabo a través del Proyecto “Vigilancia y caracterización molecular de arbovirus circulantes en Paraguay, Argentina, Uruguay y Brasil” , financiado por el Programa de Asociación de Proyectos Conjuntos de Investigación del MERCOSUR. A través de estas capacitaciones se realizó la transferencia de los procedimientos a ser implementados.
Además, las colectas iniciales de mosquitos fueron acompañadas por un profesional experto del Laboratorio de Virología J.M. Vanella y un experto local del Servicio Nacional de Erradicación de Paludismo (SENEPA) y se llevaron a cabo en el marco del Proyecto “Aspectos ecológicos y epidemiológicos de Flavivirus y sus vectores en una zona urbana y rural del Paraguay” . Los mencionados profesionales acompañaron todo el proceso desde la selección de lugares apropiados para colocación e instalación de las trampas de mosquitos, correcto almacenamiento, transporte de muestras hasta el lugar de procesamiento, y la preparación de los pools de mosquitos para la posterior realización de técnicas de RT-PCR. Para el registro de datos, así como para el control de transporte y almacenamiento se utilizaron planillas que fueron completadas tanto en el lugar de colecta, como en el IICS-UNA, donde los mosquitos capturados fueron almacenados, para la posterior identificación de las especies de mosquitos, formación de los pools y la detección de flavivirus en los mismos. A continuación, se presenta el flujograma de trabajo; (Figura 1).
Población de mosquitos
Las colectas de mosquitos fueron llevadas a cabo en el marco del Proyecto “Aspectos ecológicos y epidemiológicos de Flavivirus y sus vectores en una zona urbana y rural del Paraguay” .
La recolección se realizó mediante la utilización de trampas de luz tipo CDC suplementadas con hielo seco y trampas BG Sentinel del SENEPA. Se colocaron en promedio 8 trampas por colecta las cuales permanecieron activas desde las 18:00 horas hasta las 09:00 horas del día siguiente, aproximadamente. Se realizaron como mínimo 2 noches de captura por localidad y por zonas. Cada trampa se identificó con un código y se registró el lugar donde la instaló, el horario de colocación y retiro de la misma.
Los mosquitos colectados se transportaron refrigerados en hielo seco y/o nitrógeno líquido al IICS-UNA, hasta su procesamiento.
Preparación de pools de mosquitos
Los mosquitos colectados fueron identificados taxonómicamente en frío según la clave de Darsie22 por un profesional entomólogo del SENEPA, agrupándose en pools de 1 a 35 mosquitos por especie, localidad, fecha de colecta y estado alimentario (alimentado con sangre, no alimentado con sangre). Estos pools fueron homogenizados en morteros estériles y diluidos en medio esencial mínimo (MEM) suplementado al 10% con suero fetal bovino (SFB), 1% con antibiótico (gentamicina) y 1% con antimicótico (fungizona). Los homogeneizados fueron centrifugados a 11.400 g durante 30 min en centrífuga refrigerada para su descontaminación. Los sobrenadantes obtenidos se recuperaron y almacenaron en tubos Eppendorf a -80ºC hasta su procesamiento.
Extracción de ARN viral
La extracción de ARN viral fue llevada a cabo a partir de 200 uL de muestra (pools de mosquitos). Se utilizó el kit comercial NucleoSpin Virus (Macherey Nagel, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN extraído fue eluído con un total de 30 uL de tampón de elución, almacenados a -80°C hasta su procesamiento.
RT-PCR para detección de ARN de actina-1
Para evaluar la integridad de los pools de mosquitos extraídos se llevó a cabo una RT-PCR para la detección de ARN de actina-1 descripta por Staley y colaboradores en el año 201023. Solamente los pools con control interno positivo fueron sometidos a la detección de flavivirus.
Búsqueda del genoma de flavivirus mediante RT-nested PCR genérica
La búsqueda del genoma de flavivirus se realizó a través de la reacción de RT-nested-PCR descripta por Sánchez-Seco y col. en el año 2005, previamente implementada en el laboratorio con muestras de suero de pacientes febriles21. En el presente estudio se utilizaron random primers (Byodinamics, AR) para la retrotranscripción que fue realizada con la transcriptasa reversa Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) (Promega, EUA). Mientras que los primers específicos constituyeron primers degenerados que amplifican una región conservada que codifica para la proteína NS5 (región parcial NS5)21. Los productos de amplificación de la nested PCR fueron guardados a -20ºC para posterior envío a secuenciación en los casos necesarios.
Secuenciación de productos de amplificación obtenidas de muestras seleccionadas
Se seleccionaron aleatoriamente pools de mosquito positivos para flavivirus y los fragmentos amplificados por RT-PCR fueron purificados mediante el kit comercial AxyPrep DNA Gel Extraction (Axygen Biosciences, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante y posteriormente fueron sometidos a secuenciación nucleotídica por el método de Sanger a través del servicio de la empresa Macrogen (Seoul, Corea del Sur).
Las secuencias de nucleótidos fueron analizadas y editadas con el software BioEdit v7.0.7.0. Las secuencias obtenidas se compararon mediante el algoritmoBasic Local Alignment Search Tool (BLAST) con las secuencias de nucleótidos del gen NS5 de los flavivirus existentes en la base de datos del GenBank del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)24.
RESULTADOS
RT-PCR para detección de ARN de actina-1
Del total de mosquitos colectados fueron procesados 1803 contenidos en 201 pools. La selección se realizó de acuerdo a las especies de mosquitos reportadas como vectores de arbovirus (principalmente Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, entre otras). Los 201 pools de mosquitos fueron positivos para el control interno (ARN de actina-1) (Figura 2).
Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de los productos amplificados para la actina-1. Carriles 1 al 4 y Carriles 6 al 9: muestras de pools de mosquitos sometidos a RT-PCR para el gen de actina-1 donde se observa el tamaño esperado de 683 pb23. Carril 5: marcador de pares de bases.
Las 201 muestras fueron sometidas a la detección genérica de Flavivirus descripta por Sanchez Seco y colaboradores, 2005 (18). El 45,2% (91/201) de los pools analizados fueron positivos siendo los más frecuentemente detectados (65/91; 71,43%) aquellos conformados por Culex quinquefasciatus (Tabla 1, Figura 3).
Tabla 1. Frecuencia de muestras positivas para el género Flavivirus por especie.
| Especie | Frecuencia | % |
|---|---|---|
| Culex quinquefasciatus | 65 | 71,43 |
| Aedes aegypti | 17 | 18,68 |
| Culex (Melanoconium) sp. | 5 | 5,49 |
| Ochlerotatus scapularis | 2 | 2,20 |
| Ochlerotatus sp. | 1 | 1,10 |
| Coquilletidia sp. | 1 | 1,10 |
| Total | 91 | 100,00 |
Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados por RT-nested PCR para detección de Flavivirus (21). Carriles 1-4 y 6: muestras de pools de mosquitos sometidos a RT-nested PCR para Flavivirus donde en las muestras positivas (1,2,3,6) se observa el tamaño esperado de 143 pb (18). Carril 5: marcador de pares de bases. Carril 7: Control positivo y Carril 8: Control Negativo.
Secuenciación de muestras positivas para Flavivirus
Del total de pools positivos, se seleccionaron aleatoriamente 20 muestras positivas para Flavivirus las cuales fueron enviadas para su secuenciación a la empresa Macrogen, Corea. En relación a las secuencias obtenidas a partir de la reacción de RT-nested PCR genérica para flavivirus, se obtuvieron fragmentos de secuencias analizables de 78 a 90 pb, obteniendo como resultado de BLAST porcentajes de identidades del 91 al 99% con secuencias de Cell fusion agent virus y otros flavivirus de mosquitos depositadas en el GenBank. No se obtuvo la secuencia de una de las muestras debido a la baja concentración de la misma. En la Figura 4 se pueden observar el resultado del BLAST realizado para uno de los pools.
Figura 4: Resultado de alineamiento por BLAST de una secuencia de nucleótidos parcial del gen NS5 de muestra de Aedes aegypti positiva para flavivirus. Se muestran los resultados de BLAST obtenidos de un Pool de mosquito positivo para flavivirus y en la parte inferior el alineamiento con la secuencia con número de acceso del GenBank LC496857.1
De los pools analizados 2/19 correspondieron a CxFV (Ochlerotatus scapularis y Culex quinquefasciatus con un 93 al 97% de identidad), 17/19 a flavivirus de Aedes aegyti con 91 al 100% de identidad (virus Kamiti River, virus agente viral de fusión celular, entre otros).
DISCUSIÓN
Los flavivirus son una preocupación real para la salud pública18. En este estudio se implementó un sistema de detección de flavivirus en mosquitos.
Las capacitaciones realizadas de los profesionales locales, el cumplimiento de los procedimientos, registro de datos, así como controles utilizados (control interno, positivo y negativo) en las técnicas de RT-PCR convencionales, facilitaron considerablemente la implementación del sistema de detección de flavivirus en mosquitos en el IICS-UNA.
En la selección de la técnica de RT-PCR para detección de flavivirus se tuvo en cuenta que la misma sea rápida, simple y detecte un amplio número de patógenos con elevada sensibilidad. Para ello se utilizó la RT-nested PCR descripta por Sánchez-Seco y col., 2005 que usa primers universales género-específico que permiten la detección teóricamente de todos los virus que se encuentran dentro del género Flavivirus de importancia médica o ecológica como los flavivirus de insectos, con una buena sensibilidad, posibilitando el diagnóstico y vigilancia de un número mayor de infecciones, optimizando de este modo el uso de recursos4,18,21,25. Además, podría emplearse para establecer el agente causal de brotes de manera eficiente, ya que el producto de amplificación obtenido en la nested PCR de 143 pb por secuenciación permite identificar de qué flavivirus se trata16. Otra ventaja es que la primera reacción (RT- PCR) también puede ir combinada con una nested PCR con primers específicos que permitan identificar flavivirus de importancia médica como DENV 1-4 utilizando los productos de amplificación de la primera reacción descripta por Sanchez-Seco et al., 200518,19.
Todos los pools de mosquitos preparados fueron sometidos a la detección de ARN de actina-1 como control interno. La detección de este control interno en todos los pools testeados demuestra que el proceso de preparación y de extracción de los mismos fue óptimo23,25.
Además, 91/201 (45,2%) pooles fueron positivos para Flavivirus a partir de RT-nested PCR. 19 pools fueron secuenciados, identificándose en los mismos ISFV. Ambos resultados mencionados anteriormente indican la exitosa implementación de la técnica de detección de flavivirus en pools de mosquitos. Pero como ya fue mencionado es necesaria la utilización combinada de otras técnicas como la secuenciación o la realización de RT-PCRs específicas para la identificación específica de la especie de Flavivirus. Otra de las ventajas es que las PCRs específicas pueden realizarse a través del cDNA obtenido por la transcripción reversa20.
Además, la elevada detección de ISFV en este estudio y la alta prevalencia reportada previamente en mosquitos de Paraguay y Brasil25, sugieren una amplia circulación de los ISFV (principalmente de CxFv), por lo cual sería de utilidad la implementación de técnicas para detección de los mismos, las cuales podrían ser incorporadas dentro del sistema de detección de flavivirus propuesto en el presente estudio, a fin de facilitar la identificación de potenciales pools de mosquitos positivos para flavivirus de importancia médica.
Si bien los flavivirus de insectos no son causantes de enfermedades, los mismos presentan nuevas oportunidades en la evolución viral, en el estudio de la interacción virus/vector y además tienen un enorme potencial como agentes para el control biológico de vectores de importancia médica26.
En conclusión, el presente estudio ha permitido la implementación de un sistema de detección de flavivirus, el cual podrá ser utilizado para explorar infecciones virales en mosquitos que actúan como vectores de flavivirus de importancia médica (DENV, ZIKV, SLEV, etc.) y también los ISFV, con miras a un mayor conocimiento de la distribución de estos virus en nuestro país y en la región, constituyendo así una herramienta de importancia para la vigilancia y el control de la transmisión de estos virus.
