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Memorias del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud

On-line version ISSN 1812-9528

Mem. Inst. Investig. Cienc. Salud vol.17 no.1 Asunción Apr. 2019

http://dx.doi.org/10.18004/mem.iics/1812-9528/2019.017(01)25-031 

ARTÍCULO ORIGINAL

Enterovirus asociados a Afecciones del Sistema Nervioso Central confirmados por biología molecular

Enteroviruses associated with Central Nervous System Infections confirmed by molecular biology

Carmen Portillo1  , Eugenio Báez2  , Martin Agüero3  , Wilfrido Coronel4  , Gloria Samudio5 

1Laboratorio Portillo. Asunción, Paraguay

2Sanatorio Migone. Asunción, Paraguay

3Centro Medico La Costa. Asunción, Paraguay

4Hospital Central-Instituto de Previsión Social. Paraguay

5Gran Hospital Nacional. ItaguaParaguay

RESUMEN

Aproximadamente 90% de las meningitis asépticas son causadas por enterovirus (EV), miembro de la familia de los picornavirus. Los EV son ubicuos, se diseminan por vía fecal-oral y contacto directo, responsables de brotes o casos esporádicos con importante morbilidad. El diagnóstico se basa en la presentación clínica, imágenes, estudio citoquímico del líquido cefalorraquídeo (LCR) y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), gold estándard que reemplaza al aislamiento viral y la serología. El objetivo de este estudio descriptivo de corte transversal fue determinar la presencia de EV por RT-PCR en el LCR de pacientes con sospecha clínica de meningitis aséptica, internados en servicios públicos y privados de Asunción y departamento Central del Paraguay de noviembre de 2007 a noviembre de 2014. El material genético fue extraído mediante el mini kit ADN y ARN Qiagen® que fue sometido a RT-PCR. Se incluyeron LCR de 203 pacientes, 124 (61%) niños (4 días-15 años) y 79 (39%) adultos (16-81 años). Setenta y siete (38%) provenían de servicios públicos y 126 (62%) de privados; 115 (57%) fueron varones. Se detectó RNA de EV en 166 (82%) pacientes, 90 niños y 76 adultos, y mayor número de casos entre los meses de octubre a abril. Este es el primer trabajo en el país y muestra una importante participación del EV en pacientes por infecciones del SNC compatibles con meningitis asépticas de etiología viral. La sospecha clínica fue mayor en niños, sin embargo la proporción de resultados positivos fue mayor en adultos. Se observó mayor circulación en los meses cálidos.

Palabras-clave: enterovirus; meningitis; PCR; Paraguay

ABSTRACT

Approximately 90% of aseptic meningitis is caused by enterovirus (EV), a member of the Picornavirus family. EV is ubiquitous, spread by fecal-oral route and direct contact and responsible for outbreaks or sporadic cases with important morbidity. Diagnosis is based on clinical presentation, cerebrospinal fluid (CSF) analysis and polymerase chain reaction (PCR), the gold standard that substitutes viral isolation and serology. The objective of this descriptive, cross-sectional study was to identify EV by RT-PCR in the CSF of patients with clinical suspicion of aseptic meningitis, admitted to public and private medical centers of Asuncion and the Central Department of Paraguay from November 2007 to November 2014. Extraction of genetic material was carried out with Quiagen® DNA and RNA minikit which was subjected to a RT-PCR. CSF samples from 203 patients were included, 124 (61%) were children (range 4 days-15 years) and 79 (39%) adults (age range 16-81 years). Seventy seven (38%) were from public hospitals and 126 (62%) from private health centers; 115 (57%) were males. Enterovirus RNA was detected in 166 (82%) samples, 90 (54%) from children and 76 (46%) from adults. Most of the positive samples were collected from October to April. This study is the first in Paraguay and showed important involvement of EV in patients with infections of the NCS compatible with aseptic meningitis of viral etiology. Clinical suspect was higher in children, however, positive rate were greater in adults. Positive cases were more frequent in the hot season.

Key words: enterovirus; meningitis; PCR; Paraguay

INTRODUCCIÓN

Las infecciones del sistema nervioso central causadas por virus aunque no son frecuentes tienen importancia debido a su gravedad, constituyendo una emergencia pediátrica ya que su rápido diagnóstico y manejo son decisivos en el pronóstico y seguimiento de la evolución. Entre ellas, la meningitis y encefalitis son cuadros agudos más frecuentes.

Los virus son agentes de reconocida prevalencia en el líquido cefalorraquídeo (LCR) claro o aséptico, compatible con meningitis (inflamación meníngea del espacio subaracnoideo) asociándose en 90% a enterovirus humanos (EV), tanto en niños como en adultos, sin predominio de género1.

El género Enterovirus perteneciente a la familia de los Picornavirus son virus ARN de menor tamaño, con más de 100 serotipos, ubicuos y de diseminación fecal - oral, siendo el tracto alimentario, la principal puerta de entrada por contacto directo o indirecto con manos o aguas contaminadas. El periodo de incubación es de 7 a 14 días y las personas con infección subclínica pueden eliminarlos en las heces por varias semanas y en faringe por 1 a 2 semanas2. Son responsables de brotes o casos esporádicos, que varían según la época del año, la localización geográfica, edad y el nivel socio-económico. En países templados se observan frecuentemente en las estaciones cálidas pero en los tropicales durante todo el año, siendo los Coxsackie B5 y los Echovirus 4,6,9,11 y 30, los que producen las meningitis con frecuencia y con importante morbilidad3. Entre ellos podemos mencionar a Estados Unidos de Norteamérica, donde probablemente causen alrededor de las tres cuartas partes de todos los casos de meningitis viral notificados. En México constituyen causa importante de meningitis viral y son responsables del 80 -90% de las Encefalitis, en lactantes y menores de 5 años, identificándose los Coxsackie B5, B2, B4, B3, B1 y los Echovirus 11, 9, 30, 4, 6, 3, 7, 5 y 215. En Japón, se reportó el Echovirus tipo 9 en 1990 y en Alemania, un brote en 21 niños por Echovirus tipo 30, con una tasa de ataque de 24%, en 1997. En países de nuestra Región, la Argentina reporto casos desde el 1983 asociados a los Coxsackie B1, B3 y B5 así como a los Echovirus 11, 21 y 258.

Más del 90% de las afecciones por los enterovirus pueden ser asintomáticas y los cuadros varían desde el sindrome pie-mano-boca hasta pericarditis y meningitis. Otro aspecto importante de la etiología de los enterovirus son las infecciones neonatales, que se adquieren de la madre o por transmisión nosocomial. La frecuencia con que se aísla un determinado serotipo varía marcadamente, ya que algunos se detectan por varios años produciendo epidemias y luego desaparecen en la siguiente estación.

El diagnóstico de la meningitis viral se basa en la presentación clínica, que generalmente es aguda con signos meníngeos, imágenes, el estudio cito químico del líquido cefalorraquídeo, junto a la identificación del agente etiológico. La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), actualmente se constituye en el Gold Standard, reemplazando así al aislamiento viral y serología debido su rapidez, sensibilidad (100%) y especificidad del 95-100%4. La más utilizada es la RT-PCR genérica que detecta todos los serotipos de Enterovirus al amplificar la región 5 NC, más conservada del genoma5. La PCR permite diferenciarlas del Virus Herpes Simple, posibilitando el manejo clínico con tratamiento de soporte general, suspendiendo el antiviral (Aciclovir) instaurado, ya que el cuadro es auto limitado, se resuelve en cinco a siete días, disminuyendo los días de internación así como el costo de atención6.

En nuestro país los primeros datos disponibles sobre la participación de los Enterovirus en pacientes hospitalizados por serología (IgG e IgM) fueron reportados por Portillo et al. en el 20047. El objetivo de este estudio fue identificar al EV por PCR en el LCR de pacientes con sospecha clínica de meningitis asépticas, internados en diferentes servicios públicos y privados, de Asunción y Departamento Central de noviembre de 2007 a noviembre de 2014.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio descriptivo de corte transversal realizado desde noviembre del 2007 a noviembre de 2014 e incluyó las muestras remitidas al laboratorio de líquidos cefalorraquídeos de pacientes de todas las edades, internados en diferentes servicios públicos y privados del país bajo la sospecha clínica de meningitis por EV por manifestar signos meníngeos y un estudio citoquímico aséptico o a liquido claro.

La extracción de material genético se realizó con el mini kit ARN de Qiagen® utilizando 200 µl de muestra, seguido de una RT con 5 µl del ARN obtenido mediante el Kit MMLV y RNasout de Invitrogen®, llevándolos en el termociclador Mastercycler Personal Eppendorf® a 37°C por 45 min y posteriormente a 94°C por 10 minutos.

En la PCR se realizó la amplificación de la región 5 no codificante pero muy conservada para los EV de acuerdo al protocolo modificado de Giacca (1993)7 en 50 µl de volumen final con la Taq DNA Polimerasa recombinante de Invitrogen®, una primera ronda de 45 ciclos de 94°C por 1 min, 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 68°C por 30 segundos y una extensión final de 68°C por 3 min. Del producto obtenido se tomaron 1 ul para la segunda ronda con 35 ciclos de 94°C por 5 minutos, 94°C por 30 segundos, 49°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos y una extensión final de 72°C por 5 min, también a un volumen de 50 ul. Los primers CX3, CX8, CX9 Y CX10 utilizados fueron sintetizados por Invitrogen® y detectaron unos productos de 230 - 120 pb, visualizados en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. El límite de detección fue de 5 copias/ml y los controles positivos que fueron gentilmente proveídos por el Instituto Carlos Malbrán-Argentina. Todo este protocolo se pasó a tiempo real, desde el 2011 utilizando el equipo Rotor gene® y los Iscript Selectc DNA Synthesis Kit y Master mixSso Fast Eva Green Supermix de Bio Rad respectivamente.

Análisis estadístico

Se utilizó estadística descriptiva calculándose las frecuencias y los porcentajes de enterovirus hallados y su distribución por año, estación y edad.

Aspectos éticos

El estudio es retrospectivo de revisión de fichas de pacientes que tuvieron indicación de estudio laboratorial para su diagnóstico. Se preservó la identidad de los pacientes utilizando solo códigos garantizando así el anonimato en los resultados.

RESULTADOS

Se incluyeron muestras de LCR de 203 pacientes internados con sospecha de meningitis por enterovirus por el reporte de un citoquímico (aséptico) compatible con etiología viral, de ellos 124 (61%) fueron de niños con edades comprendidas entre 4 días a 15 años y un 79 (39%) de adultos de 16-81 años. Setenta y siete pacientes (38%) provenían de servicios públicos y 126 (62%) de privados; 115 (57%) fueron del sexo masculino y 88 (43%) del sexo femenino.

Tabla 1: Pacientes con sospecha de meningitis por enterovirus. Paraguay 2007-2016.  

Características Nº de muestras %
Edades Menores de 1 año 33 16
1 a 5 años 95 47
6 a 10 años 54 27
11 a 15 años 21 10
1 a 15 173 85
16 a 30 47 23
31 a 45 23 11
46 a 60 8 4
61 a 75 6 3
76 a 85 4 2
Sexo Femenino 88 43
Masculino 115 57
Procedencia Privado 126 62
Publico 77 38

En 166 de los LCR se detectó el ARN del Enterovirus con un 82% de positividad, diagnosticándose así meningitis viral afectando principalmente niños (Figura 1), en 90 casos (54 %) niños y a 76 (46%) adultos, siendo el menor de 4 días y el mayor de 81 años.

Figura 1: Enterovirus detectados por grupo etario. Paraguay, 2007-2014. n: 166 

En cuanto a la distribución por sexo, los EV se detectaron en 101 varones (61%) y en 65 mujeres (39%). En su mayoría correspondieron a pacientes internados en diferentes servicios del sector privado 111 (62%) y en el público 56 (38%).

La distribución los casos positivos detectados por año mostró un aumento gradual coincidente con el aumento del número de muestras estudiadas, pero con un 50% como mínimo en cada año, tal como lo muestra en la siguiente Figura 2.

Figura 2: Enterovirus en infecciones del SNC. Paraguay, 207-2014 n: 203 

En cuanto a la distribución estacional, desde el 2011, se observaron más detecciones de casos positivos de octubre a abril, coincidentes con los meses más calurosos en el país, tal como se observa en la Figura 3.

Figura 3: Distribución mensual de los Enterovirus. Paraguay, 2007-2014. n: 166 

DISCUSIÓN

Este primer estudio en el país, con un periodo de 7 años, confirmó un 82% de participación del EV mediante la PCR, en pacientes internados en diferentes servicios, con sospecha de meningitis agudas asépticas de etiología viral. En todos los años el predominio fue de niños (54%), que se observó claramente en el 2013 con 35 casos (65 %) de 54 muestras, aunque este fue el grupo mayoritario analizado, constituyéndose así estos datos en la línea de base nacional.

Los casos de meningoencefalitis afectan en primer lugar a lactantes, lo que se reflejó en nuestra casuística que incluyó a niños desde 4 días de vida, quienes generalmente aún tienen el sistema inmunológico débil, por lo requieren de un diagnóstico oportuno que les garantice la vida. Luego los mayores de 15 años, que constituyen población activa y por último al grupo de los adultos mayores, prácticamente inmunsuprimidos19, con un paciente de 81 años de edad en este grupo.

Asumiendo que esta etiología viral es difícil de predecir basados únicamente en la presentación clínica y el cito químico del LCR, el 82% por PCR aportó un diagnóstico rápido y confiable14.

Esta PCR, que utilizó una región muy conservada del genoma entre diversos genotipos de enterovirus18, posibilitó la identificación rápida de ARN de enterovirus en los casos sospechosos de meningitis aséptica, permitiendo la disminución del tiempo de internación, las complicaciones secundarias (extravasación de la canalización e infecciones nosocomiales) y el uso de antibióticos innecesarios así como el Acyclovir16.

Se observó un mismo patrón de circulación de EV todos los años pero con más actividad en los meses calurosos, más claramente desde el 2011(81%) coincidente con el incremento de muestras analizadas, lo que indica además la utilidad de esta nueva herramienta diagnóstica, ya que la PCR fue asumida gradualmente por los médicos mejorando así el manejo clínico del paciente.

La participación de los enterovirus en nuestro país fue similar a la registrada en Perú con 83,3% en las meningitis agudas asépticas y en 38,8% en las encefalitis en población pediátrica, también con comportamiento estacional, frecuente en los climas cálidos y en Panamá con un 73%, entre 1998 y 199917.

Entre el periodo de 2007 a 2014, los porcentajes de positividad de EV fueron de un 50% o más, confirmando que en nuestro país circulan en todos los años y además se correlacionaron con lo observado en Argentina entre el 2005- 2008 que reportó un 70 %8 y que luego en el 2005 - 2010 disminuyó a un 42 %11,12. En Salvador, Bahía la frecuencia de enterovirus detectados fue de 37,7% en el año 200215.

Sin embargo fueron muy elevadas en comparación a la casuística del Brasil, en Rio de Janeiro con un 11%, entre el 2005-20069, en Uruguay con un 10% por el grupo de Burgeño A, en el 2009-201010) y la casuística en Colombia, Armenia mostró un 10% de detección de enterovirus por PCR también en niños18. También un estudio multicéntrico europeo de Vliet en 199323, mostró 24,5% de detección por esta metodología comparada con el aislamiento en cultivo que fue solo de 7,5%.

En cuanto a que la mayoría de las muestras (62%) provenían de servicios privados, esto se relacionaría por un lado, con que en el Servicio Público se prioriza la búsqueda de HSV por su gravedad y la necesidad de iniciar el tratamiento con Aciclovir y por otro lado, a los limitados recursos económicos del paciente hospitalario generalmente, puesto que esta metodología aún no está disponible en los hospitales públicos.

Es indiscutible la ventaja que aporta el diagnóstico viral rápido mediante la PCR, en una enfermedad que, aunque benigna, no tiene un tratamiento antiviral específico, tiene un inicio agudo y preocupante. Por tanto tiene sus beneficios no solo para el paciente sino en la comunidad por su impacto en la economía de la salud, al disminuir el consumo de antibióticos como la disminución de la resistencia20.

Si bien el 82% de HEV observado fue elevado y aún falta analizarlo en detalle, sirven para considerar que es una patología importante en nuestro país porque se registran anualmente, causando morbilidad debido a que todas ellas requirieron internación y sería conveniente analizar si hay relación con la calidad y tipo de las aguas a la que accede la población u otra fuente de transmisión a fin de disminuirlas22.

También es importante considerar que la PCR anidada no permitió la diferenciación entre los diferentes enterovirus, por lo que requirió de modificaciones al pasarlas en tiempo real, pero que es imperiosa, la implementación de la Genotipificación a fin de conocer y diferenciar el serotipo circulante en cada temporada13,21.

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Received: November 01, 2018; Accepted: February 01, 2019

Autor Correspondiente: Carmen Portillo. Bioquímica, Directora del Laboratorio Portillo Email: portillolab@gmail.com

Este trabajo se realizó con financiación propia y en ausencia de conflicto de intereses.

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