INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas está incluida dentro del grupo de enfermedades tropicales desatendidas y está asociada a un nivel socioeconómico bajo, afectando principalmente a la población de escasos recursos que vive en condiciones de extrema pobreza¹.

El agente causal de la enfermedad de Chagas es el parásito Trypanosoma cruzi que es capaz de infectar a varias especies de mamíferos incluyendo al ser humano, así como de insectos de la subfamilia Triatominae, mayoritariamente de los géneros Triatoma, Panstrongylus y Rhodnius^2-4. La principal vía de transmisión al ser humano es a través de la picadura del insecto infectado, mediante la introducción de los parásitos presentes en sus heces a través de la herida o las mucosas. Además, existen otras vías de transmisión, tales como las transfusiones sanguíneas, de la madre infectada al hijo durante el embarazo, y por vía oral por alimentos contaminados con T. cruzi^5,6.

El ciclo vital del parásito comprende cuatro estadíos morfológicos: tripomastigote metaciclico, promastigote o tripomastigote sanguíneo, epimastigote y amastigote en el huésped mamífero. Estos estadíos se diferencian de acuerdo a la posición del flagelo y del cinetoplasto, el cual es una estructura que consta de ADN propio⁷.

Además de las diferentes morfologías que presenta T. cruzi en el transcurso de su ciclo vital, las diferentes cepas presentan una gran diversidad biológica, bioquímica y genética. Ésto ha dado lugar a la clasificación de las mismas en unidades taxonómicas discretas (UTDs), de acuerdo a marcadores moleculares, genéticos e inmunológicos. Las UTDs se definen como conjuntos de poblaciones que son genéticamente más similares entre sí que a cualquier otra población y son identificables por marcadores moleculares comunes, y actualmente son 6 designados como TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV y TcVI^8,9.

Dentro del grupo TcVI se encuentra el clon CL Brener, derivado de la cepa CL, de gran importancia debido a que fue el organismo de referencia para el “Proyecto genoma de Trypanosoma cruzi”. Ya que se conocen a profundidad varios aspectos de éste clon, como por ejemplo las condiciones óptimas de cultivo y su infectividad en líneas celulares y ratones, es ampliamente empleado en estudios que involucran a T. cruzi¹⁰. Otra cepa frecuentemente empleada en investigación es Ypsilon (Y), correspondiente al grupo TcII, cuyo extracto antigénico fue utilizado en la producción de kits de ELISA y el desarrollo de un test rápido inmunocromatográfico en nuestro país en el Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud^11,12.

A nivel nacional se ha reportado la circulación de cepas correspondientes a las 6 UTDs, con lo que se evidencia la heterogeneidad de cepas de T. cruzi circulantes a las cuales la población vulnerable se encontraría expuesta¹³.

Para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas se deben tener en cuenta los aspectos clínicos, epidemiológicos y laboratoriales. Es necesario conocer en qué etapa de la infección se encuentra el paciente, ya que en la fase aguda la parasitemia es elevada y se puede realizar la observación directa del parásito en sangre periférica por medio de microscopía, así como también se lo puede detectar por medio de hemocultivo, xenodiagnóstico y métodos moleculares^6,14.

Por otro lado, en la fase crónica la carga parasitaria en sangre es escasa, por lo que se realiza la detección de los anticuerpos generados por el paciente. Se emplean ampliamente para dicho fin la inmunofluorescencia indirecta(IFI), la hemaglutinación indirecta (HI) y la técnica de ensayo inmunoenzimático (ELISA). A pesar de los múltiples métodos empleados en la detección de la enfermedad de Chagas, no existe una técnica considerada gold standard, existiendo inconvenientes en las técnicas empleadas a nivel comercialpor las variaciones de sensibilidad y especificidad^14,15.

Un inconveniente adicional en los países co-endémicos para T. cruzi y Leishmania spp. se relaciona con los resultados falsos positivos, debido a que ambos parásitos poseen una filogenia común muy cercana, y comparten características antigénicas¹⁶. Es por ello que la Organización Mundial de la Salud recomienda que el diagnóstico se realice por al menos dos métodos con principio diferente, y hasta por tres métodos en casos de discordancia de resultados¹⁷. Una alternativa a esta situación comprende el empleo de proteínas recombinantes específicas de T. cruzi en la elaboración de los métodos de diagnóstico, con el objetivo de aumentar la especificidad¹⁴.Debido a la amplia variabilidad entre cepas de T. cruzi y las reacciones inespecíficas que se presentan con otros tripanosomátidos, sobre todo con Leishmania spp., es necesario conocer y comprender el perfil de antigenicidad de las cepas empleadas en los distintos métodos para poder discriminar con criterio un resultado ambiguo, y de ser posible emplear técnicas que incluyan a las cepas circulantes de la zona. En este trabajo se realizó una caracterización del perfil antigénico de los extractos proteicos solubles de diferentes cepas de T. cruzi, incluyendo una cepa aislada en Paraguay y otras cepas como CL Brener e Y, con el fin de aportar información preliminar de relevancia para posteriores proyectos de investigación sobre la detección de la enfermedad de Chagas en nuestro país.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Perfil proteico de los extractos de T. cruzi

La cuantificación de proteínas de los extractos solubles de las cepas CL Brener, cepa Y Lote 73 y Lote 74 y Py obtenidas fueron del rango de 0,048 a 2,010 mg/mL, siendo el Lote 74 el que presentó mayor concentración. Las concentraciones de proteínas solubles para cada extracto se muestran en la Tabla 1. Se observó que el extracto de la cepa Py presentó una concentración de proteínas de orden menor que los demás extractos estudiados, por lo que se decidió no incluirlo en el estudio preliminar de funcionalidad antigénica por Western blot.

Tabla 1. Concentraciones de proteínas de los extractos analizados 

Se realizó SDS-PAGE para describir cuales de las proteínas identificadas serían las responsables de la capacidad antigénica de cada extracto. Se evaluaron tres extractos, Y lote 73, Y Lote 74, Py y CL Brener. Por medio de la separación por SDS-PAGE de las proteínas presentes en cada extracto de T. cruzi obtenido y coloración con azul de Coomassie, se pudo observar un patrón de bandas bastante similar para los extractos Y Lote 73 e Y Lote 74, los cuales diferían a su vez de los obtenidos con los extractos de CL Brener y la cepa Paraguaya (Figura 1).

Figura 1. Perfil de proteínas de los cuatro extractos de T. cruzi estudiados. 

En la región de proteínas de bajo peso molecular (<70 kDa), sobre todo en el rango comprendido entre 20 y 70 kDa, se observaron bandas comunes entre ambos extractos que podrían corresponder a las mismas proteínas.La mayor cantidad de bandas comunes en 2 o más extractos se observó en la región comprendida entre 24 y 40 kDa (Tabla 2).

El ensayo para evaluar la antigenicidad de los diferentes extractos de T. cruzi se realizó por el método de ELISA observándose que todos ellos presentaban reactividad tanto con los controles positivos como con los sueros chagásicos. En el caso de los sueros considerados no chagásicos, dos de ellos presentaron valores superiores pero cercanos al punto de corte con todos los extractos, considerándose por tanto como indefinidos (Tabla 3).Se obtuvieron resultados discordantes con 2 sueros, M6 y M8, los valores de absorbancia fueron cercanos al punto de corte establecido para cada extracto. Para validar los ensayos, se tuvo en cuenta el comportamiento del control negativo, el cual en todos los casos dio absorbancias inferiores al punto de corte.

Se observaron las absorbancias de los sueros chagásicos con el extracto antigénico de Py, valores superiores a las absorbancias obtenidas con los demás extractos en todos los casos, excepto con los sueros controles positivos (Tabla 3).

Tabla 2. Perfil de proteínas de los extractos de T. cruzi analizados (*) 

*Se señalan en negrita las bandas comunes a dos o más extractos. ^a: Peso molecular de las proteínas detectadas, expresado en kDa;^b: Intensidad relativa de las bandas detectadas, expresadas en porcentaje. Análisis realizado mediante el software Image Lab 5.2.1.

Tabla 3. Resultados de la evaluación de la antigenicidad de los extractos de T. cruzi frente a sueros y controles positivos o negativos para Chagas, mediante ELISA. 

^a : Resultado de origen para Chagas según exámenes previos realizados en otros laboratorios. ^b : Resultado según ELISA realizado en el Departamento de Producción. ^c: Sueros chagásicos. ^d: Sueros no chagásicos. En negrita se señalan los resultados discordantes entre estudios previos vs. resultados del ELISA con los extractos ensayados. P: Positivo, N: Negativo, I: Indefinido.

Se realizó la inmunodetección de las proteínas de los diferentes extractos de T. cruzi transferidas a una membrana de Inmobilon-P, previamente resueltas en el gel de poliacrilamida. Se observó reacción en cada uno de los extractos con el suero control positivo (Figura2 A), mientras que al emplear el suero control negativo no se observó reacción, a excepción del extracto de CL Brener, el cual presentó dos bandas de bajo peso molecular inmunogénicas (< a 70 kDa) (Figura 2 B).

La reacción del suero control positivo frente a las proteínas antigénicas de los tres extractos ensayados con este método fue apreciable, observándose un reconocimiento antigénico a lo largo de cada carril. Se destacaron las bandas de pesos moleculares aproximados de 18, 38 y 48 kDa, compartidas por los extractos de Y Lote 73 y 74, además de las de 19, 20 y 25 kDa, comunes para los tres extractos.

Por otro lado, las bandas observadas en la reacción del suero control negativo frente al extracto de CL Brener corresponderían a las de 51 kDa y a una banda de gran grosor en la zona comprendida entre 75 y 135 kDa. No se observó reconocimiento antigénico de la proteína mayoritaria de CL Brener de 62,5 kDa (Figura 2 B).

Figura 2. Inmunoblot de extractos proteicos de cepas de T. cruzi.  

DISCUSIÓN

Los extractos de las cepas Y Lote 74, Lote 73 y CL Brener partieron de una concentración de parásito mayor, sin embargo, en el caso de la cepa Py, el extracto se encontraba conservado en seroteca desde el 2011 por lo que probablemente haya sufrido la degradación de sus proteínas por el prolongado tiempo de almacenamiento.

La fracción cepa Py presenta proteínas de reconocimiento inmunitario 51,38,31,27, 23 kDa, que coinciden dentro del rango reportado por Riera y col como 100% presentes en los enfermos de Chagas¹⁸. Las bandas de 41 y 32 kDa, presentan de mayor proporción con respecto a las demás observadas, siendo las diferencias en cuanto a las intensidades entre extractos probablemente por distintos niveles de expresión en las diferentes cepas.

Se esperaba encontrar una marcada diferencia en cuanto al patrón de bandas de los extractos de Y Lote 73 y 74 debido a las condiciones de mantenimiento diferentes sin embargo esto no fue observado en su totalidad coincidiendo con otros estudios^19,20.

Se pudo observar variabilidad entre los mismos en la zona de bandas de alto peso molecular (>70 kDa).Estudios previos han reportado similitud con estos resultados¹⁹, aunque no se observa una concordancia exacta de pesos moleculares con los hallados en esta investigación. Esto podría explicarse por las diferencias intrínsecas entre corridas electroforéticas y baja exactitud al asignar pesos moleculares, incluso empleando softwares de análisis de imágenes.

Al contrastar el perfil proteico de los extractos de Y Lote 73 y 74 con los de las demás cepas estudiadas, se observó una diferencia mayor en los patrones de bandas. En el caso del clon CL Brener, el cual no sólo consiste en una cepa diferente, sino también en otra UTD (TcVI), se observó una banda mayoritaria de peso molecular aproximado de 62,5 kDa, que correspondió a casi el 50% del total de la intensidad relativa de las bandas observadas y no estuvo presente en los demás extractos.

La cepa Py, por su parte, fue sembrada en el gel en una cantidad menor, por ser su concentración inferior con respecto a las de los demás extractos empleados. Sin embargo, se observaron tenues bandas de proteínas, mayoritariamente de peso menor a 70 kDa, destacándose las de 31, 27, 57 y 33 kDa por su mayor porcentaje relativo.

Es muy importante mencionar que en la enfermedad de Chagas el diagnóstico no debe estar basado solamente en un método, sino que el resultado debe necesariamente ser confirmado con otro método basado en un principio diferente, como recomienda la OMS¹⁷. Esto obedece a una elevada proporción de resultados discordantes por la falta de estandarización de técnicas apropiadas de detección^21,22, y debe tenerse aún más en cuenta en países coendémicos para T. cruzi y Leishmania spp.²³ como lo es el nuestro, por la ocurrencia de reacciones cruzadas. Además, el método de detección previo de las muestras de la seroteca, realizado por otros laboratorios, pudo haber sido elaborado con una cepa o fracción antigénica diferente, o bien los antígenos empleados en este estudio están reaccionando de manera inespecífica con sueros de pacientes que no están infectados con T. cruzi.

Los sueros de pacientes paraguayos infectados con T. cruzi presentaban mayor respuesta inmune frente a una cepa de circulación local, reconociendo probablemente un mayor número de epítopos de la misma con una variedad mayor de anticuerpos. Esta tendencia no se reprodujo en el caso de los sueros controles positivos, probablemente debido a que los mismos fueron seleccionados de acuerdo a su reacción con la cepa Y que es la que se emplea para la preparación de los kits de detección de T. cruzi de los cuales forman parte, presentando efectivamente una absorbancia mayor con los extractos que procedían de dicha cepa, Y Lote 73 y 74.

La reacción inespecífica con un suero no chagásico pudo haber tenido lugar por reacciones cruzadas con otros tripanosomátidos como Leishmania spp. oT. rangeli¹⁶.

Por otro lado, los extractos de proteínas empleados son extractos crudos, que contienen una mezcla compleja de proteínas solubles de T. cruzi, ante los cuales existiría una enorme diversidad de anticuerpos en el suero.

En conclusión, el perfil proteico particular de cada extracto analizado, evidenciado por medio de SDS-PAGE, permitió detectar diferencias en cuanto a las cepas, particularmente entre las que pertenecían a unidades taxonómicas diferentes.

Se comprobó la actividad antigénica de todos los extractos mediante el test con sueros chagásicos y no chagásicos por la técnica de ELISA. En cuanto al perfil antigénico de los extractos de T. cruzi mediante Western blot, se corroboró la antigenicidad de ciertas proteínas de bajo peso molecular en los extractos al ser testeados con un suero chagásico, además de la observación de reacción inespecífica, sobre todo con proteínas de alto peso molecular, lo que podría optimizarse empleando antígenos más purificados.