INTRODUCCIÓN

Las plantas medicinales son utilizadas en muchos países del mundo. En el Paraguay el consumo de plantas medicinales y aromáticas es tradicional y generalizado, una costumbre que se heredó de los tiempos de los guaraníes^1,2. Entre estas plantas tenemos la Luehea divaricata Mart., conocida popularmente en el Paraguay como ka´aovetî o ka´aovetîpytâ; a nivel regional tiene una distribución que abarca Brasil, Uruguay y Argentina³.La flor se utiliza como anticoqueluche, antitusígeno, antiasmático, antidiabético, carmitivo, contra el ácido úrico⁴.A pesar de su amplia utilización en la medicina popular, son pocos los estudios sobre los posibles efectos secundarios de los extractos de esta especie. Entre los trabajos realizados encontramos un estudio del extracto acuoso de las hojas de L. divaricata en Salmonella typhimurium, en el que se observó que tiene un efecto mutagénico en la cepa TA 98, al ser activada con la fracción microsomal S9⁵. Estudios del potencial mutagénico en Drosophila melanogasterhan mostrado que el extracto acuoso de la corteza de L. divaricata fue negativo en los cruzamientos Standard y de alta bioactivación; al combinarse el extracto acuoso de la corteza con un mutágeno conocido, la Doxorubicina (DRX), se ha observado un efecto reductor de la acción mutagénica de manera significativa, al reducir significativamente las frecuencias de manchas de pelos mutantes en las alas de D. melanogaster, al ser comparadas con los datos obtenidos en el tratamiento de DRX solo⁶, lo que indicaría un efecto protector del extracto de L.divaricata frente a agentes mutagénicos. En estudios previos, realizados por nuestro equipo de trabajo, hemos encontrado que el extracto acuoso de L. divaricata no presentó efectos genotóxicos en células de médula ósea de ratones, cuando fueron tratadas con el extracto acuoso por 48 hs⁷. Los extractos de plantas medicinales pueden presentar efectos tóxicos en las células de los organismos tratados⁸ o presentar efectos protectores frente a daños hepatotóxicos, inflamatorios⁹ o genotóxicos, lo que indica que tienen el efecto de inducir la disminución de daño en el ADN o aumentar el mecanismo de reparación en células o tejidos expuestos a agentes físicos, químicos o biológicos^10,11,12,13. Considerando que extractos de plantas medicinales o comestibles son utilizadas como protectores de daños a tejidos del organismo se podría utilizar el extracto de L. divaricata con esta finalidad. El objetivo de este trabajo fue el de analizar el efecto protector del extracto acuoso de la L. divaricata en células de médula ósea de ratones, utilizando el Test de Micronúcleo¹⁴.

MATERIALES Y MÉTODOS

Especie vegetal. Las muestras de L. divaricata fueron colectadas en la ciudad de San Lorenzo e identificadas por la Lic. Biol. Bonifacia de Bertoni, del Herbario de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (FACEN) de la Universidad Nacional de Asunción (UNA). El número de colecta de la autora principal es 02 y el "voucher" de la especie fue depositado en el Herbario de FACEN-UNA.

Preparación del extracto de la planta. Para obtener el extracto acuoso de las hojas de L. divaricata, se colocaron 10gr de hojas maceradas, previamente deshidratadas a 40ºC en estufa, en 100mL de agua destilada, a 80ºC, que se mantuvo por 10 minutos sobre la plancha calefactora, se dejó enfriar y se filtró con dos sistemas de filtros, filtro común y filtro de 0,45μm. El trabajo de investigación fue realizado en el laboratorio de Biotecnología (CEMIT-DGICT-UNA).

Animales. Para este estudio se utilizaron 20 (veinte) ratones Swiss albinos sanos, hembras, de 20 a 30 gr de peso y entre 6 a 12 semanas de vida. Los animales fueron mantenidos en el laboratorio de Biotecnología por una semana para su aclimatación con comida y agua ad libitum. Teniendo en cuenta los códigos de ética para trabajos de experimentación con animales de laboratorio, se ha evitado todo sufrimiento innecesario del animal y se ha empleado el mínimo número requerido con valor estadísticamente aceptable.

Técnica para análisis in vivo de micronúcleos

Los animales fueron divididos en 4 grupos de 5 animales; Grupo1:control negativo, al cual se administró 200 μL de agua potable, vía oral (v.o.);Grupo 2:control positivo, al cual se administró 50mg /Kg peso de animal vía intraperitoneal (i.p.) deciclofosfamida (CAS Nº:6055-19-2, Sigma); ambos tratamientos fueron 24 hs antes del sacrificio. Grupo 3:al cual se administró el extracto acuoso de la planta L divaricata, 200 μL, i.p., 48 y 24 hs antes del sacrificio, Grupo 4: al cual se administró 200 uL del extracto acuoso v.o. a48 y 24h antes del sacrifico y 50mg/Kg peso del animal, 24h antes del sacrificio. Se sacrificaron los animales, se retiraron los fémures y se removió la médula ósea con suero fetal bovino (FBS); mantenido a 37°C. Se homogenizaron las muestras y se transfirieron a tubos cónicos, se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Se desechó el sobrenadante dejando un pequeño volumen para resuspender las células. Se resuspendieron las células restantes, se colocaron 1-2 gotas sobre una lámina de cristal limpia y seca y se realizó el extendido, se dejaron secar las muestras y se fijaron las mismas en metanol absoluto. Se tiñeron las muestras con Giemsa al 4%. Se analizaron las muestras al microscopio óptico con aumento de inmersión y se contaron 1000 Eritrocitos Policromáticos (EPCs) incluyendo los que presentaron Micronúcleos (EPCMNs). Para el análisis de citotoxicidad se contaron 200 eritrocitos por animal tratado para establecer el porcentaje de EPCs; la disminución de este porcentaje en los animales tratados es indicativa de toxicidad o supresión de células de médula ósea. Se utilizaron 5 animales por volumen de extracto analizado, así como en los controles del ensayo. Los análisis estadísticos se realizaron con la ayuda del software Excel 2007 ( Microsoft Excel), Past 3¹⁵ y BioEstat 5.3¹⁶. La reducción de daño se calculó de las medias del Índice de daño (ID) en los grupos tratados con CP, extracto y CP (Ld) y grupo Control negativo (CTL-), conforme a la fórmula¹⁷: % Reducción=Media ID Ld-Media CP/Media Ld-Media CTL-.

RESULTADOS

En la Tabla 1se muestra las frecuencias (números) de Micronúcleos (MNs) en células de médula ósea de ratones tratados con el extracto acuoso de L. divaricata, sola o en combinación con el quimioterápico ciclofosfamida. Fueron analizadas 5.000 células por grupo de tratamiento, la frecuencia de MNs en el grupo de L. divaricata 200µL fue de 0,58% sobre el total de células analizadas y no presentó diferencia estadísticamente significativa cuando es comparada con la frecuencia encontrada en el control negativo (0.44). La frecuencia de MNs en el Grupo 3 presentó una frecuencia de MNs de 1,54%, y del Grupo 4 fue de 2,6%, en 5.000 células analizadas en cada grupo; ambas frecuencias fueron estadísticamente significativa cuando fueron comparadas con la frecuencia del Grupo 1. Se encontraron diferencias significativas al compararse las frecuencias del Grupo 3 y el Grupo 4; donde hemos verificado un % de Reducción en la frecuencia de MNs de 49% en el Grupo3 y que fue estadísticamente significativo.

Tabla 1 Frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados, Media y Desvío Standard (SD), en médula ósea de ratones. 

A₁, ... A_5;animales de cada tratamiento_; ^aestadísticamente comparado con el Grupo 1. ^bestadísticamente comparado con el Grupo 4. *Diferencia estadísticamente significativa( p≤0.05)

DISCUSIÓN

Este estudio investigó la actividad protectora de la planta L. divaricata frente a un agente genotóxico conocido y el ensayo de Micronúcleo, utilizado como biomarcador, provee información sobre el potencial genotóxico de los agentes que son testados. Este ensayo permite la detección del efecto clastogénico (quiebras de cromosomas) o aneugénico (pérdida de cromosomas enteros). Este efecto se verifica analizando las modificaciones en la frecuencia de micronúcleos, es altamente sensible, fácil de realizar, de bajo costo¹⁸ y se utiliza tanto para verificar los efectos tóxicos o los efectos protectores de agentes químicos, físicos o biológicos Estos ensayos son válidos tanto para realizar un estudio de los efectos genotóxicos (clastogénicos o aneugénicos) de algunas substancias como para estudiar los posibles efectos protectores de otras^19,20. La Ciclofosfamida (CP), es un quimioterápico que produce aberraciones cromosómica sin vitro²¹ e in vivo y micronúcleos en las células de la médula ósea de ratones tratados con una dosis simple del fármaco^22,23.

La acción del extracto de L. divaricata ya fue estudiada en células tumorales, con acción citotóxica sobre las mismas y con acción anti fúngica en Staphylococcus aureus. Felicio et al.⁶⁾ han demostrado los efectos protectores del extracto frente al daño producido por un mutágeno en células de D. melanogaster. En este trabajo los animales pre-tratados con el extracto acuoso de L. divaricata y luego tratados con CP han mostrado una disminución significativa en la frecuencia de MNs en células de médula ósea, lo que se debería al efecto protector del extracto, por disminución de daño sobre el DNA y/o por activación de los mecanismos de reparación de las células. Los extractos de plantas medicinales o comestibles se utilizan como terapéuticos o protectores frente a daños producidos en el organismo por agentes exógenos, su eficacia debe ser demostrada en estudios científicos; el extracto acuoso de L. divaricata analizado en este trabajo ha mostrado tener un efecto reductor del daño al genoma inducido por un mutágeno conocido; para sugerir su utilización como protector se recomienda otros estudios complementares, tanto in vivo como in vitro.