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Memorias del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud

On-line version ISSN 1812-9528

Mem. Inst. Investig. Cienc. Salud vol.14 no.2 Asunción Aug. 2016

https://doi.org/10.18004/Mem.iics/1812-9528/2016.014(02)17-024 

Articulo Original/ Original Article

 

Análisis filogenético y de presión evolutiva de secuencias nucleotídicas del gen VP4 de especies de enterovirus humanos

 

Phylogenetic and evolutive pressure analyses of nucleotide sequences of VP4 gene of human enterovirus species

 

Alina Acosta CabelloI, Graciela Russomando II, Emilio E. Espínola II**

IFacultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción. Paraguay

IIDepartamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigación en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asunción. Paraguay

 

* AAC presentó parte de este estudio como trabajo de grado, para obtener el título de Bioquímica

 


R E S U M E N

El género Enterovirus es un grupo viral que afecta a un amplio rango de hospederos, entre ellos los humanos (especies A, B, C, y D), causan enfermedades respiratorias, gastrointestinales, neurológicas, y otras, y son altamente contagiosos. Los síntomas pueden ser leves o graves. El objetivo del trabajo fue analizar la variación nucleotídica, filogenética y de presión evolutiva de secuencias nucleotídicas del gen VP4 de las cuatro especies que afectan a los humanos. Se emplearon 92 secuencias nucleotídicas disponibles en la base de datos GenBank; éstas se editaron con el software BioEdit y se alinearon con Clustal W; las relaciones filogenéticas se determinaron con MEGA6, y las presiones evolutivas con los algoritmos SNAP y SLAC. Se encontró que la identidad nucleotídica mínima intra-especie fue de 43,2% (especie B) a 72,6% (especie D). Los genotipos más variables por especie fueron EV-71 (A), Echovirus 2 (B), EV-118 (C), y EV-94 (D). El análisis de presión evolutiva mostró que el gen VP4 en las cuatro especies evoluciona bajo presión selectiva negativa. Esto indicaría que la alta tasa mutacional y eventos de recombinación no tienen un rol significativo en la evolución de este gen, debido probablemente a la localización interna de la proteína VP4.

Palabras claves: Enterovirus humanos, secuencias nucleotídicas, gen VP4, análisis filogenético, presión selectiva.


A B S T R A C T

The Enterovirus genus is a viral group that affects a wide host range, including humans (species A, B, C and D), cause respiratory, gastrointestinal, and neurologic disease, among others, and are highly contagious. The symptoms range from mild to severe. The objective of this study was to perform a nucleotidic variation, phylogenetic and selective pressure analyses of the VP4 gene from the four enterovirus species that affect humans. Ninety-two nucleotide sequences (available in the GenBank database) were employed; they were edited with BioEdit software and aligned with Clustal W; the phylogenetic relationships were determined with MEGA6, and the evolutive pressures with SNAP and SLAC algorithms. It was found an intra-species nucleotide identity of at least 43,2% (species B) to 72,6% (species D). The more variable genotypes by species were EV-71 (A), Echovirus 2 (B), EV-118 (C), and EV-94 (D). The selective pressure analysis showed that VP4 gene of the four species evolves by negative pressure. This would indicate that the high mutation rate and recombination events do not have a significant role in the evolution of this gene, probably due to the internal localization of the VP4 protein.

Key words: Human enteroviruses, nucleotide sequences, VP4 gene, phylogenetic analysis, selective pressure.


 

INTRODUCCCIÓN

Los Enterovirus, pertenecientes a la familia Picornaviridae, comprenden un grupo de virus de tamaño pequeño y RNA como material genético (1). Los viriones son esferoidales, con un diámetro de aproximadamente 30 nanómetros. La cápside es simétrica y posee un arreglo de 60 subunidades llamadas protómeros, dispuestas en una estructura icosaédrica altamente empaquetada; cada protómero está formado por 4 proteínas estructurales denominadas proteínas virales (VP). En la superficie, cada bloque está constituido por VP1, VP2 y VP3, y en la parte interna están relacionadas con VP4 (1). El RNA viral es infeccioso porque una vez dentro de la célula huésped genera todas las proteínas virales requeridas para la replicación viral (1).

Se clasifican en 10 especies: Human enterovirus A, B, C y D; Simian enterovirus, Bovine enterovirus, Porcine enterovirus B; y Human rinhovirus A, B y C. La clasificación se realiza en función a la identidad aminoacídica de proteínas externas compartida por los miembros de una especie; por lo tanto, cada especie enteroviral comprende características en común compartidas por los miembros que los conforman (1).

Los Enterovirus humanos no se limitan a afectar exclusivamente el tracto gastrointestinal o respiratorio; también pueden producir infecciones del sistema nervioso central (meninges y encéfalo), páncreas, corazón y también se los han relacionado con la aparición de diabetes mellitus (2).

La variabilidad genética es una determinante importante en la generación de nuevos tipos o variantes virales. Entre los principales mecanismos generadores de variabilidad en virus RNA se encuentran las mutaciones y recombinaciones. Las mutaciones nucleotídicas pueden darse debido a la incapacidad de la RNA polimerasa de corregir errores durante la replicación, lo que ocasiona elevadas tasas de mutaciones por sustitución (3). La recombinación, originada por intercambio genético entre dos cepas virales al infectar una misma célula, puede originar cepas con características muy distintas a las predecesoras; este mecanismo, aparte de contribuir a la variabilidad genética y la generación de nuevos virus, reduce la carga mutacional (4, 5).

La presión selectiva se define como el grado con que los organismos son favorecidos o desfavorecidos por las mutaciones genéticas (6), pudiendo ocasionar dos escenarios posibles: 1) el cambio en el codón no produce cambio en el aminoácido codificado (denominado sustitución sinónima), y 2) el cambio en el codón produce cambio del aminoácido (denominado sustitución no sinónima). Una presión selectiva positiva implica que la variación aminoacídica que sufrió el gen, favoreció a la especie en su supervivencia. La presión negativa, en cambio, se refiere a que las condiciones de selección negativa para ese gen han permanecido iguales, eliminando los cambios que favoreciesen a la especie (7).

Las reconstrucciones filogenéticas son utilizadas como una herramienta útil para el análisis evolutivo de secuencias génicas, permitiendo la clasificación de los genes estudiados de manera más sencilla y relacionándolos con factores evolutivos de la especie y la historia demográfica de las poblaciones en estudio. Además, se puede obtener información sobre la dinámica de los virus a partir de la estructura de las ramas en un árbol filogenético (8).

En América Latina, existen datos de circulación de las cuatro especies de enterovirus humanos, en mayor porcentaje los genotipos de la especie B (9). En Paraguay no existen datos precisos sobre especies ni genotipos enterovirales asociados a manifestaciones clínicas, por lo que este estudio podría utilizarse como punto de partida para análisis moleculares de enterovirus de importancia en Salud Pública en nuestro país.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de secuencias nucleotídicas

Se obtuvieron en total 92 secuencias nucleotídicas de referencia del gen de VP4 de enterovirus humanos (especies A, B, C, y D), de la base de datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov); cada gen estaba conformado por 67 codones (201 nucleótidos); cada secuencia correspondió a un genotipo representativo por especie, según asignación taxonómica en la base de datos de los picornavirus (http://www.picornaviridae.com/). El número de secuencias obtenidas por especie fue de 17 para la especie A, 55 para la B, 17 para la C y 3 para la D.

Análisis filogenético y de identidad nucleotídica

Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron manualmente editadas con BioEdit v.7.0.5 (10). El alineamiento múltiple de secuencias fue realizado con Clustal W (11). La reconstrucción filogenética fue realizada con el método de neighbor-joining, utilizando el método de Kimura 2-parámetros como modelo de sustitución nucleotídica, y análisis de bootstrap de 1.000 réplicas con el programa MEGA v6 (12). Para el cálculo de identidad nucleotídica, se realizó un análisis de distancia entre pares de secuencias (pairwise distance) dentro de una misma especie, utilizando el programa MEGA v6 (12); a partir de las distancias, se dedujeron las identidades (expresadas en porcentajes).

Análisis de las presiones selectivas

Para el análisis de presión selectiva, se utilizó el método de Nei y Gojobori (7). Los datos fueron analizados utilizando el programa SNAP (13), basado en el lenguaje de programación Perl; para ello, se partió de un alineamiento múltiple de secuencias, y se contabilizó el número de cambios sinónimos y no sinónimos para cada codón. Al hallar la relación entre las sustituciones no sinónimas (dn) y sinónimas (ds), i.e. dn/ds, si el valor es 1, la presión de selección es neutra; si el valor es menor a 1 implica una presión de selección negativa, y si es mayor a 1, una presión selectiva positiva (7).

La determinación del número de codones bajo presión selectiva positiva, negativa o neutra se estimó con el algoritmo “Single likelihood ancestor counting” (SLAC) de la interfase Datamonkey (14).

 

RESULTADOS

Se encontró que la identidad nucleotídica mínima intra-especie fue de 43,2% (especie B) a 72,6% (especie D) (Tabla 1). Los genotipos más variables por especie fueron EV-71 (A), Echovirus 2 (B), EV-118 (C), y EV-94 (D) (Tabla 1).

 

 

El análisis SNAP de presión selectiva de enterovirus humanos de las especies A, B, y C demostró que el gen VP4 evoluciona mediante presión selectiva negativa, con tasas dn/ds que van de 0,0145 hasta 0,0359 (Tabla 2).  No se realizó el análisis de la especie D debido al escaso número de secuencias disponibles (se necesitan como mínimo tres secuencias de genotipo distinto). Mediante el algoritmo SLAC, se determinó que el número de codones bajo presión selectiva negativa fue de 66/67 codones; no se observaron codones bajo presión positiva.

 

 

La relación entre las cuatro especies de enterovirus humanos por análisis filogenético (Figura 1) demostró la relación entre Enterovirus A y Enterovirus D, debido al agrupamiento de estas especies en un único cluster, con un valor bootstrap de 86%. Los genotipos de Enterovirus B y Enterovirus C formaron clusters separados (Figura 1).

 

 

 

DISCUSIÓN

En los últimos años han aumentado las aplicaciones de técnicas bioinformáticas para comprender la epidemiología molecular de las enfermedades ocasionadas por enterovirus; por ejemplo, mediante tales herramientas se descifró el genoma de diversos enterovirus (15), se identificaron las regiones genómicas de importancia funcional, se determinaron las relaciones genéticas entre las diferentes cepas (16),así como también se reportaron mecanismos probables de generación de variabilidad genética y evolución viral (17, 18).

Este trabajo se ha enfocado en el análisis del gen codificante de la proteína VP4 de genotipos representativos de enterovirus humanos, debido a que esta proteína tiene importancia estructural para la cápside viral (19), está estrechamente relacionada al genoma viral (20), y por poseer una secuencia conservada entre los enterovirus.

En el análisis de variación nucleotídica intra-especie, se observaron porcentajes mínimos de identidad de 43,2% (especie B) a 72,6% (especie D). El bajo porcentaje de identidad nucleotídica dentro de la especie B se debería a eventos de recombinación genética intra-especie entre genotipos relacionados (5); dentro de esta especie, el genotipo de menor identidad nucleotídica correspondió al echovirus 2, que son altamente infecciosos, sobre todo en pacientes pediátricos, lo que favorece la aparición de brotes y por consiguiente el incremento de la tasa mutacional (21). El alto porcentaje de identidad nucleotídica dentro de la especie D podría deberse a que las cepas pertenecientes a este grupo son de circulación reciente, probablemente derivados de la especie A (según nuestro análisis filogenético); dentro de la especie D, EV-94 fue el genotipo de menor identidad nucleotídica, el cual muestra altas tasas mutacionales según estudios epidemiológicos a nivel mundial, y es relativamente nuevo con respecto a los demás genotipos de la especie D (22, 23) . En cuanto a la especie A, el genotipo de menor identidad fue el EV-71, que está asociado a diversas patologías, y no solo a problemas de boca, pies y manos; además, es el virus no-polio más dañino a nivel neuromotor (24). Fue comprobado que el EV-71 sufre cambios adaptativos en el genoma (25), sobre todo en la proteína VP1 que confiere resistencia a algunos inhibidores virales (26). Por último, dentro de la especie C, el genotipo de menor identidad fue el EV-118, correspondiente a un nuevo tipo enteroviral identificado dentro de esta especie; la región nucleotídica no traducida de EV-C118 es filogenéticamente distinta a la de los enterovirus humanos de la especie C clásicos; no obstante, está estrechamente relacionado con el EV-109 y el EV-105 (27-29). Esto también se aprecia en el árbol filogenético que obtuvimos en nuestro análisis, lo que podría sugerir un origen de recombinación y posible evolución independiente de las diferentes regiones genómicas del EV-118 (29).

En cuanto al análisis de los patrones de sustituciones sinónimas y no sinónimas, se observó que el gen VP4 de las especies de enterovirus humano A, B, y C, evoluciona por presión negativa. Esto indicaría que la alta tasa mutacional y eventos de recombinación no tienen un rol muy significativo en la evolución de este gen, debido probablemente a la localización interna de la proteína VP4, que no está bajo la presión selectiva del sistema inmune del hospedero. Esto sí ocurre con los genes codificantes de las proteínas expuestas en la superficie viral, tales como VP1 y VP2 (30-32).

En los últimos años se ha detectado la circulación de enterovirus humanos causantes de altas tasas de morbilidad y mortalidad en el mundo; por ejemplo, en 2014, se reportó en Estados Unidos de América un brote de enterovirus 68 (especie D) que causó enfermedad respiratoria severa en niños, por lo que es considerado como un patógeno reemergente (33, 34). Por esto, es importante establecer líneas de investigación que permitan identificar y genotipificar los enterovirus circulantes en el Paraguay.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Fecha de recepción:junio 2016. Fecha de aceptación: agosto 2016
Autor correspondiente: *Emilio Espínola
. Instituto de Investigación en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay.
E-mail: emilioespinola@hotmail.com

 

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