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Memorias del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud

versão On-line ISSN 1812-9528

Resumo

CHENA, L et al. Estandarización de la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial cyt bcomo herramientapara la identificación de fuentes de alimentación de insectos hematófagos. Mem. Inst. Investig. Cienc. Salud [online]. 2014, vol.12, n.2, pp.33-42. ISSN 1812-9528.

La identificación de la fuente de alimentación de insectos hematófagos puede proporcionar información sobre la capacidad vectorial, patrones de alimentación en condiciones naturales y proveer indirectamente datos sobre probables reservorios de enfermedades. Varias técnicas de identificación son empleadas, entre ellas las más utilizadas son las basadas en reacciones antígeno-anticuerpo. Actualmente, se han desarrollado ensayos moleculares, algunos de ellos permiten detectar e identificar solo sangre humana. Otros como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen mitocondrial citocromo b (cyt b), que ha mostrado alto grado de sensibilidad y especificidad, permite detectar e identificar otras especies de vertebrados. El objetivo del trabajo fue estandarizar la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial citocromo b(cyt b) para determinar la fuente de alimentación sanguínea de insectos. Inicialmente se realizó un análisis bioinformático para la búsqueda y alineamiento de secuencias del gen cyt bde los potenciales huéspedes, con secuencias que están disponible en el GenBank. Se utilizaron 10 muestras de sangre de potenciales huéspedes vertebrados (humano, perro, gallina y roedor) y para la reacción de PCR se empleó un par de cebadores universales que amplifican una región del gen cyt b, seguido de cortes con dos enzimas de restricción (RFLP) (HaeIII y MwoI), generando patrones de electroforesis específicos para los diferentes vertebrados. Se logró la estandarización de la técnica de PCR del gen cyt b que fue capaz de detectar ADN de al menos 1 µL de sangre observándose el producto de amplificación de 358 pb. El análisis de los patrones de bandas obtenidos con el corte de las enzimas mostró los tamaños de fragmentos esperados para humano, gallina, perro y roedor. Estos resultados muestran la utilidad de la técnica PCR-RFLP del gen cyt bque, con un simple par de cebadores seguido del corte con dos enzimas de restricción, permitió diferenciar las diferentes especies de vertebrados de nuestro interés a través de los patrones obtenidos sin llegar a la secuenciación y también presenta la ventaja de utilizar pequeños volúmenes de sangre.

Palavras-chave : PCR; RFLP; citocromo b; fuente de alimentación; leishmaniosis.

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