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INTRODUCCIÓN
El cáncer de mama (CM) corresponde a un conjunto diverso de enfermedades1 , caracterizado por la proliferación rápida, descontrolada y desordenada de las células mamarias como consecuencia de alteraciones a nivel de los mecanismos de la división y muerte celular2. Representa un 30,7% entre los diferentes tipos de cáncer que son diagnosticados a nivel mundial3
En Paraguay, aproximadamente 1.747 personas fueron diagnosticadas con cáncer de mama en el año 2019, observándose una prevalencia de 25 por cada 100.000 habitantes4. Particularmente, en el departamento de Itapúa, se cuenta con un Hospital que atiende exclusivamente a pacientes oncológicos, el “Hospital Día Oncológico de Itapúa” sin embargo no se encontraron reportes oficiales del Ministerio de Salud sobre la cantidad exacta de mujeres afectadas con cáncer de mama.
Muchos factores están implicados en el desarrollo de esta patología, no encontrándose una causa identificable en mucho de los casos; sin embargo, el 5-10 % son atribuidos a mutaciones genéticas hereditarias4,5. Con la introducción de las pruebas genéticas se ha logrado la detección de varios genes relacionados con la susceptibilidad de padecer cáncer de mama y muchos otros que aún se siguen estudiando, los primeros en evidenciarse fueron los genes BRCA 1 y BRCA 2, dos genes de alta penetrancia y prevalencia. La distribución de variantes en tales genes varía de acuerdo a ciertas características demográficas como ser la raza y la situación geográfica6.
Desde el descubrimiento de los genes de susceptibilidad al cáncer de mama, BRCA1 y BRCA2, diversos estudios han concluido que el 5% de los casos se explican por la existencia de mutaciones patogénicas en dichos genes, los cuales tienen una predisposición genética de tipo autosómico dominante de alta penetrancia, en donde la herencia de una única mutación patogénica en alguno de estos dos genes confiere un riesgo elevado de desarrollar la enfermedad a lo largo de la vida7,8,9,10.
La Base de Datos de Secuencias Genéticas (GenBanK)11 y la Base de Datos de Variantes Genéticas Humanas Asociadas a Genotipos (ClinVar)12 permiten identificar regiones y variantes asociadas con la predisposición a padecer cáncer de mama en la región. En ese sentido, ClinVar reporta múltiples variantes de diferentes tipos y significancias clínicas reportadas para los genes mencionados, 12759 variantes en el gen BRCA1 y 15018 en BRCA2. Por otro lado, Cerretini et al.13 identificó una frecuencia del 6,3% de variantes patogénicas en los genes BRCA en una población argentina de mujeres con cáncer de mama.
De esta manera, esta investigación tuvo el propósito de desarrollar cebadores para amplificación de variantes patogénicas que se encuentran en los genes BRCA 1 y 2 asociadas a cáncer de mama, con la finalidad de contar con un método accesible y económico para realizar un primer screening en la población de mujeres itapuenses con cáncer de mama, donde aún no se cuenta con información sobre las variantes genéticas asociadas a cáncer de mama circulantes.
METODOLOGIA
Diseño del estudio: Se realizó un estudio experimental para el desarrollo de cebadores para amplificación de variantes patogénicas asociadas a cáncer de mama.
Selección de variantes: Se llevó a cabo la revisión de artículos que analizaban variantes hereditarias asociadas a cáncer de mama en América Latina14,15,16,17,18,19,20,21. Fueron seleccionadas las variantes reportadas por Cerretini et al13 en los genes BRCA1 y BRCA2, identificadas en mujeres con la ascendencia indígena/española, alemana/paraguaya, rusa/ucraniana, que puedan estar representadas en la población itapuense.
Ensayo laboratorial: Los ensayos se realizaron en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias y Tecnología de la Universidad Nacional de Itapúa.
Diseño de Cebadores: Una vez que se identificó la zona de interés para la amplificación en la secuencia, se procedió a diseñar y ensayar cebadores (oligonucleótidos que permiten la amplificación de regiones y que actúan en la etapa de hibridación a través de la técnica de Reacción de Polimerasa en Cadena de punto final (PCR). Se utilizaron las accesiones NM_000059.4, NM_024675.4 y NM_007294.4, luego de descargar las secuencias en formato fasta se procedió al diseño de cebadores específicos para la amplificación de las mutaciones de interés. Para el diseño in silico se empleó el software primer 3 versión 0.4.014. Se solicitó la síntesis de los cebadores diseñados a la empresa Macrogen-Korea.
Para la validación de los cebadores mediante PCR convencional, se empleó una muestra de ADN de un paciente voluntario al azar.
Extracción del ADN genómico: se le realizó la extracción de ADN a partir de sangre periférica con EDTA para la puesta a punto de la técnica, utilizando el kit Wizard® Genomic DNA Purification (PROMEGA)15 siguiendo las condiciones sugeridas por el fabricante para muestras de sangre.
Condiciones de la PCR: Las amplificaciones de las regiones seleccionadas fueron realizadas en un termociclador de la marca BOECO, en un volumen final de 50uL de reacción, con los siguientes reactivos: 1X de Buffer (PCR Buffer, -Mg), 1,5 mM MgCl2, 1 unidad de taq (DNA Polimerasa, Invitrogen), 0,2 mM de cada dNTPs (Promega)23, 0,5 µM de cada uno de los cebadores y aproximadamente 100ng de ADN templado. En cuanto a las condiciones de ciclado, se utilizaron condiciones estándares, desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, 35 ciclos que incluyeron, desnaturalización a 94°C por 45 s, hibridación a TM (Temperatura de melting) específica de cada cebador por 45 s, elongación a 72°C por 1 min, elongación final a 72°C por 10 min. Para la verificación de las PCR fue realizada una electroforesis (5V/cm) en geles de agarosa al 2% (p/v), utilizando como buffer de corrida TBE al 0,5 X, los geles fueron teñidos con Diamond™ Nucleic Acid Dye (1:10.000), las bandas fueron visualizadas en un transiluminador de luz azul. El marcador de peso molecular utilizado como referencia fue el 100 pb DNA Ladder (Invitrogen). Entre las variables que se manipularon para la puesta a punto de la PCR, se encuentran la TM y la concentración de MgCl2.
Secuenciación: posterior a esto los fragmentos fueron enviados para su secuenciación a la empresa Macrogen-Korea, para la verificación de las posiciones de interés, se revisó la calidad de las secuencias recibidas y se generó una secuencia consenso por medio del programa Bioedit, se comprobó la identidad de las secuencias obtenidas utilizando la herramienta Blastn24.
Asuntos éticos: Se respetaron los principios básicos de la bioética. El protocolo de investigación fue aceptado por el Comité de ética de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Itapúa.
RESULTADOS
Se diseñaron un total de 7 pares de cebadores con el programa Primer 3.0. Cumpliendo con los criterios de selección de cebadores, se seleccionaron un total de dos pares de cebadores, uno para el gen BRCA1 y otro para el gen BRCA2 (Tabla 1), todos candidatos válidos para ser sintetizados.
Tabla 1: Regiones y cebadores para la amplificación de las mutaciones asociadas a BRCA1 y BRCA2 pb: pares de base, TM: temperatura de hibridación.
| Gen | Exon | Cebadores | Mutación | pb | TM |
|---|---|---|---|---|---|
| BRCA2 | 11 | BRCA2_11F: TGGTATTGAGCCAGTATTGAAGA BRCA2_11R: AGACTGACTTATGAAGCTTCCCT | c.5351_5352insA c.5681_5682insA | 599 | 58 |
| BRCA1 | 10 | BRCA1_10F: ACAAACACCCAGGATCCTTTC BRCA1_10R: TCCATGCTTTGCTCTTCTTGA | c.4035delA | 158 | 60 |
En los ensayos realizados, utilizando las TM presentadas en la tabla 2, se observó la amplificación de un único fragmento para cada uno de los pares de cebadores diseñados, correspondiendo los tamaños a los esperados, 599 pb para BRCA2 (Figura 1, Dentro de este fragmento se encuentran las posiciones correspondientes a las mutaciones 5351_5352insA y c.5681_5682insA) y 158 pb para (fragmento que incluye la mutación c.4035delA) BRCA1. La secuencia obtenida para la región parcial del exón 11 de BRCA2 fue de buena calidad, consiguiéndose finalmente una secuencia consenso de 585 pb, en la cual no se identificaron las inserciones patogénicas en las posiciones de interés. En el caso de la región parcial del exón 10 del gen BRCA1, no fue posible obtener secuencias de buena calidad.
DISCUSIÓN
A pesar de que no existen estudios poblacionales de variantes genéticas asociadas a CM en Paraguay, la revisión bibliográfica realizada permitió seleccionar variantes específicas en los genes BRCA 1 y BRCA2 identificadas en mujeres con ascendencia paraguaya y de otros países que puedan estar representados en la población itapuense.
Los estudios genéticos más recientes sobre cáncer de mama hereditario en Latinoamérica han sido publicados en Chile25, Brasil26, México27 y Argentina13. En todas ellas, las variantes fueron identificadas mediante secuenciación de próxima generación y validadas mediante secuenciación de Sanger o amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple. Si bien las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) tienen la ventaja de realizar un screening de gran parte del genoma, con grandes beneficios en cuanto a la cobertura que brindan, el costo de la mayoría de los paneles excede los 1000USD27, un costo aun elevado para nuestra población. De esta manera, realizar el screening de variantes a través de PCR y secuenciación por la tecnología de SANGER es una opción interesante, aunque de menor cobertura en cuanto a la cantidad de variantes a analizar.
El presente trabajo, constituye la etapa inicial de un proyecto que pretende realizar un primer screening de variantes genéticas asociadas a cáncer de mama en mujeres Itapuenses. En el mismo, se han desarrollado cebadores que podrán ser utilizados en la segunda fase del trabajo. Para la selección de las variantes se tuvieron en cuenta la ascendencia y frecuencia a partir de los hallazgos de Cerretini y colaboradores13.
La especificidad de los cebadores es una de las características más importantes para tener en cuenta en el diseño, esta depende de la longitud y de la TM, si los cebadores son muy pequeños y la TM es muy baja, se generan uniones inespecíficas28. En nuestros cebadores se ha encontrado que la longitud de los pares de cebadores se encuentra entre 19 y 23 bp y la TM esta entre 39-47 °C. Con este resultado, se debe tener en cuenta que, para el diseño de cebadores para una PCR, el rango de la TM óptima se encuentra entre 60 y 64ºC con una temperatura ideal de 62ºC29.
Los cebadores desarrollados amplificaron fragmentos únicos. La secuencia resultante de la región parcial del gen BRCA1 no fue de buena calidad, probablemente debido al tamaño del fragmento; en cambio, el resultado obtenido de la secuenciación de la región parcial del gen BRCA2 permitió obtener una clara secuencia consenso de 585 pb, incluyendo dentro de la misma las dos posiciones de interés.
De este modo, este es el primer estudio que permite el desarrollo de cebadores en Itapúa para la amplificación de la región parcial del gen BRCA2. Estos cebadores podrán ser utilizados en estudios epidemiológicos para caracterizar a la población de interés en cuanto a la presencia de las dos variantes mencionadas, o de alguna otra que pueda ser encontrada de nuevo a lo largo de la región analizada.
Partiendo del hecho de que fueron incluidos únicamente los genes BRCA1 y BRCA2 y si bien son genes de alta penetrancia y prevalencia no son los únicos genes asociados a predisposición a cáncer de mama hereditario, existen muchas otras variantes e incluso otros genes que se han asociado a la predisposición de desarrollar cáncer de mama22, una limitación importante es que las variantes seleccionadas en el trabajo no son suficientes para realizar un screening representativo, puesto que, las mismas podrían no hallarse en la población a ser estudiada ya que la diversidad genética entre poblaciones es un factor relevante, por otra parte, considerando que al no existir antecedentes en la población paraguaya el trabajo se basa en un estudio realizado en una población de la región. Sin embargo, podría generar antecedentes y ser un puntapié inicial que permitirá obtener un primer screening, a partir del cual se podría ampliar el rastrillaje a otras variantes y regiones que permitan la identificación de variantes asociadas a cáncer de mama, considerando que estas pruebas con fundamentales para la toma de decisiones sobre el tratamiento, la implementación sobre estrategias preventivas y la detección temprana.
CONCLUSION
Esta investigación es el primer estudio que permite el desarrollo de cebadores en Itapúa para la secuenciación de las variantes seleccionadas del gen BRCA2, no así del gen BRCA1, a fin de poder usarlos en estudios epidemiológicos para la caracterización de poblaciones de interés.
Para complementar el estudio se deberían realizar pruebas en una PCR convencional usando muestras de ADN humano con pacientes diagnosticados con cáncer de mama y probar los productos de la PCR mediante electroforesis.
