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1. INTRODUCCIÓN
Un grave problema asociado a la seguridad alimentaria es la contaminación con hongos filamentosos y sus micotoxinas. Esto puede darse como consecuencia de la presencia de patógenos como Penicillium sp., Fusarium sp., Aspergillus sp., que pueden afectar a los cultivos tanto en condiciones de campo y/o almacenamiento1-4.
Las especies de Aspergillus pueden infectar desde insectos hasta cultivos económicamente importantes, tales como maíz, café, maní, especias, hierbas medicinales y otros5-8. Este género fúngico incluye los más importantes productores de micotoxinas, que son metabolitos secundarios de bajo peso molecular, que pueden ocasionar trastornos denominados como micotoxicosis que se manifiestan en forma de diferentes cuadros clínicos (agudos y crónicos) tanto en humanos como en animales, y que hasta ocasiona la muerte en casos extremos4,9,10).
El maní (Arachis hypogaea), también conocido como manduvi (en guaraní), cacahuate, caguate y cacahuete en otras regiones. Es consumido en todos los estratos socioeconómicos para alimentación y son muy apreciados debido sus propiedades nutricionales. En Paraguay representa un cultivo de relevancia económica para el país, sin embargo, la calidad puede ser afectada debido su susceptibilidad a la contaminación por hongos productores de las micotoxinas, como Aspergillus11,12.
En los últimos años se ha incrementado el interés por métodos alternativos para control de estos patógenos, principalmente en el periodo de almacenamiento y/o conservación, como el uso de antioxidantes y aceites esenciales, que han presentado prometedores resultados por la capacidad de reducción y/o inhibición del crecimiento fúngico y por consiguiente la producción de micotoxinas2,13,14,15.
Los aceites esenciales por su origen natural y por ende biodegradable representan una alternativa sostenible para la conservación de los alimentos, sirviendo, como un soporte a la inocuidad alimentaria y alternativa de uso de plaguicidas sintéticos15,16,17,18.
Se estima que alrededor del 60% de los aceites esenciales presentes en plantas medicinales, hierbas y especias poseen propiedades antifúngicas19,20. Los aceites esenciales de Cymbopogon martini, Eucalyptus globulus y Cinnamomum zeylanicum presentaron efectos prometedores en el control de A. fumigatus y A. niger21.
Otro compuesto propuesto con fuerte actividad antifúngica sobre cepas de Aspergillus es el aceite esencial de Origanum vulgare L. (orégano), que ha sido probado en el control de especies como A. flavus, A. parasiticus, A. terreus, A. ochraceus, A. fumigatus y A. niger22,23. Asimismo, Trajano et al.24 demostró que el aceite esencial de canela y eugenol promueven la reducción en la pigmentación de las hifas, el número de conidióforos y la inhibición del proceso de formación de conidios de cepas de Aspergillus flavus.
También se ha demostrado que los aceites esenciales de canela y pimienta asociados con etilo decanoato (FEs-C10) fueron eficiente para proteger in vivo el tomate de infecciones con hongos fitopatógenos como Aspergillus niger y Fusarium oxysporum, reforzando su potencial uso como conservantes de alimentos, prologando su vida útil25.
Para evaluar la actividad antimicrobiana de productos naturales existen diversas técnicas, una de la más difundida y ampliamente utilizada es la de difusión en agar, siendo considerada como método de screening o cribado en la búsqueda de substancias biológicamente activas26-28. La técnica de difusión en agar con disco de papel, es la estandarizada para realización de antibiogramas por CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute) y es aceptada por la FDA (Food and Drug Administration), siendo rutinariamente utilizada en laboratorios de microbiología clínica29.
No obstante, no existen técnicas estandarizadas para los ensayos antifúngicos con extractos vegetales, lo que es fácilmente visualizado en la literatura con el uso del mismo ensayo con diferentes modificaciones dificultando la reproducibilidad y comparación de los resultados26-30.
Es relevante validar las técnicas teniendo en cuenta que cada microorganismo y extracto vegetal presentan particularidades que pueden ser o no observadas por la variación de las técnicas de enfrentamiento, siendo así se propuso como objetivo de este estudio comparar dos técnicas de inoculación en el ensayo de screening para actividad antimicrobiana - difusión en agar - de aceites esenciales de especias contra cepas de Aspergillus aisladas de maní. Y a su vez, determinar el efecto antifúngico y principales fitoconstituyentes de dichos aceites frente a las cepas de Aspergillus.
2. MATERIALES Y MÉTODO
Los experimentos fueron realizados en el Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas de la Universidad Nacional de Asunción (CEMIT-UNA), San Lorenzo - Paraguay.
2.1. Aislamiento e identificación de cepas de Aspergillus
Las cepas de Aspergillus flavus y Aspergillus Sección Nigri fueron aisladas y purificadas a partir de maní (Arachis hypogaea) comercializados en supermercado. Los granos de maní no dañados fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 3%, durante tres minutos, enjuagados tres veces con agua destilada esterilizada, secados en papel de filtro estéril y posteriormente sembrados en placas de Petri de 9 cm de diámetro con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (OXOID®) sintético e incubados a 25±2°C por 7 días31.. Las cepas de Aspergillus fueron identificadas evaluando sus características macro y micromorfológicas mediante la clave de identificación de Klich, 200232. Las cepas seleccionadas fueron purificadas y conservados en agar MEA y depositados en la Colección de Cultivos de Microorganismos de la Universidad Nacional de Asunción - CCM-UNA (FELACC, SI-70). Los códigos de las cepas son: Aspergillus flavus: CCM-AFMa01 y Aspergillus Sección Nigri CCM-ANiMa01.
2.2. Aceites esenciales utilizados
Los aceites esenciales de Origanum vulgare L. (orégano); Eugenia caryophylata (clavo de olor); Cinnamomum zeylanicum (canela); eugenol y carvacrol fueron cedidos por la Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima, del Laboratorio de Micología de la Universidade Federal da Paraíba, Brasil. Los tres primeros son provenientes de FERQUIMA® y los dos últimos de Sigma-Aldrich®, Brasil.
2.3. Preparación de inoculo de cepas de Aspergillus
Cultivos puros de Aspergillus flavus y Aspergillus Sección Nigri fueron cubiertos con 5 mL de agua destilada estéril, la superficie fue raspada suavemente con un asa estéril y la solución con elementos fúngicos fue transferida a un tubo estéril. Estas suspensiones fueron agitadas durante 2 min usando un vórtex, los inóculos fueron estandarizados al tubo número 0,5 de la escala de McFarland (106 UFC.mL-1), por comparación de la turbidez.
2.4. Ensayo de la actividad antifúngica. Ensayo de difusión en agar
Se utilizó como medio de cultivo PDA que fue preparado según las instrucciones del fabricante, autoclavado a 121˚C por 15 minutos y fraccionado en 20mL por cada placa de Petri estéril de 9 cm de diámetro29.
Se utilizaron dos variaciones en la inoculación en el medio de cultivo, a. medio inoculado, b. siembra directa, con el inoculo estandarizado en 106 UFC.mL-1:
Medio inoculado: se tomaron 1.000 μL de la solución del inoculo preparado previamente y se inoculó en la placa de Petri con PDA fundido a 45º C y sembrado a profundidad.
Siembra directa: Después de solidificado el medio PDA, con auxilio de un hisopo estéril, se esparció el inoculo por todo el medio mediante estriados.
En ambas técnicas se emplearon discos de papel estéril (autoclavados a 121˚C por 15 minutos), en los cuales fueron impregnados 10 μL de los aceites esenciales y los metabolitos seleccionados. Los discos de papel impregnados con el aceite correspondiente fueron puestos en el centro de las placas inoculadas con las cepas de Aspergillus e incubados a 25 ±2°C por 7 días. El grupo control consistió en el disco impregnado con agua destilada estéril. Los ensayos fueron realizados por duplicado para cada cepa de Aspergillus y por cada técnica empleada.
A continuación, se realizó la lectura, registrando el diámetro de los halos de inhibición con un calibre digital. La actividad antifúngica de las muestras ensayadas se consideró positiva cuando los halos de inhibición alcanzaron valores mayores o iguales a 10 mm de diámetro33.
2.5. Análisis de Datos
Los resultados fueron expresados en medias ± desvío estándar y se utilizó el paquete estadístico GraphPad Prism versión 8.0.0 para Windows (GraphPad® Software, San Diego, California USA). El desempeño entre las muestras ensayadas se comparó mediante análisis de varianza (ANOVA) soportado por las múltiples comparaciones de Tukey y fue considerado significativo cuando p < 0,05. Para evaluar si había diferencia significativa entre los métodos de inoculación utilizados se realizó un ANOVA de 2 vías, seguido de la prueba de múltiples comparaciones de Bonferroni para cada aceite esencial.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Ensayos de inhibición de crecimiento in vitro de Aspergillus flavus
En la Figura 1 se observa los promedios de los halos de inhibición de los aceites esenciales evaluados sobre cepas de A. flavus (CCM-AFMa01), utilizando el método de siembra directa (A) y medio inoculado (B).
Figura 1 Promedio en milímetros de los halos inhibición del crecimiento fúngico producidos por los aceites esenciales y fitoconstituyentes sobre la cepa de Aspergillus flavus (CCM-AFMa01). A. Método de siembra directa. B. Método de medio inoculado. ANOVA post-test Tukey. Medias con una letra en común no son significativamente diferentes (p>0,05).
El aceite esencial de Origanum vulgare (orégano) y su constituyente mayoritario carvacrol demostraron los mayores promedios de halos de inhibición: 38,5 y 40 mm, seguidos del eugenol, y los aceites de canela y clavo de olor con 23, 19 y 18 mm respectivamente. Todos los aceites esenciales al ser comparados con el control demostraron inhibir el crecimiento fúngico de forma significativa, y pueden ser considerados con potencial actividad antifúngica, ya que los extractos vegetales son considerados prometedores cuando el halo de inhibición es igual o mayor a 10 mm27,33. A su vez también presentaron diferencias significativas (p< 0,05) los aceites de orégano y carvacrol al compararlos con los demás aceites (Figura 1) coincidiendo con lo informado por Abbaszadeh et al. (34, que demostraron el efecto antifúngico de carvacrol y eugenol, in vitro frente a once especies fúngicas contaminantes de alimentos, entre ellas cepas de Aspergillus, afirmando su potencial como conservantes.
En cuanto al eugenol (23 mm), son varios los mecanismos de acción reportados frente a células fúngicas, tales como que alteran la permeabilidad de la membrana de forma no-especifica; afectan el transporte de iones ATP; produce especies reactivas de oxígeno intracelular, convergiendo en la muerte celular35. El aceite del clavo de olor, que mostró un halo de inhibición de 18 mm, es reportado por sus propiedades antioxidantes, además de su acción antimicrobiana, lo que incrementa su potencial como alternativa para su uso en la industria para prevenir el crecimiento de microorganismos bacterianos y fúngicos y la degradación de los alimentos36.
El aceite esencial de orégano comparado con el carvacrol no presentó diferencias significativas (p>0,05) sobre el control de A. flavus. A su vez, no se observa diferencia significativa entre el eugenol, conocido fitoconstituyente del aceite esencial de canela y el clavo de olor con el aceite de estos en su efecto antifúngico. El eugenol es el principal compuesto volátil de los botones y hojas de clavo de olor (Eugenia caryophyllata Thunb.) y de varias plantas pertenecientes a las familias Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae, y Myristicaceae35. En nuestro trabajo no observamos diferencia significativa en el efecto inhibitorio fúngico del aceite esencial de clavo de olor y del eugenol (Figura 1 - A), coincidiendo con lo reportado por Mahboubi & Mahboubi36, que atribuyen el efecto antimicrobiano del aceite esencial de clavo de olor al alto contenido de eugenol.
En cuanto al método de medio inoculado, se observó el mismo perfil de inhibición, sin embargo, con menores dimensiones de los halos de inhibición: carvacrol (39 mm) y el aceite de orégano (27 mm), seguido de eugenol (16 mm), y los aceites de clavo de olor (10 mm) y canela (9 mm) (Figura 1-B).
Se puede observar que el método de inoculación influenció en las dimensiones de los halos de inhibición de los aceites esenciales y fitoconstituyentes estudiados frente los aislados Aspergillus flavus
3.2. Ensayos de inhibición de crecimiento fúngico Aspergillus Sección Nigri
En los ensayos realizados sobre la cepa de Aspergillus sección Nigri (CCM-ANiMa01), todas las muestras mostraron inhibición del crecimiento del hongo, utilizando los dos métodos: siembra directa y medio inoculado, tal como se observa en las figuras 2 A y B.
Figura 2 Promedio en milímetros de los halos inhibición del crecimiento fúngico producidos por los aceites esenciales y fitoconstituyentes sobre la cepa de Aspergillus sección Nigri (CCM-ANiMa01). A. Método de siembra directa. B. Método de medio inoculado. ANOVA post-test Tukey. Medias con una letra en común no son significativamente diferentes (p>0,05).
El aceite esencial de orégano y el carvacrol presentaron mayores halos de inhibición, 40 mm con relación a los demás aceites evaluados (Figura 2 A y B). Ambos presentaron diferencias significativas (p < 0,05) cuando fueron comparados con el eugenol y los aceites esenciales de canela y clavo de olor, resultados similares a los efectos sobre la cepa de A. flavus evaluada en este estudio. Carvacrol es el fitoconstituyente mayoritario del aceite esencial de orégano y de otras plantas aromáticas como Thymus pulegioides que posee efecto antifúngico frente diferentes especies de Aspergillus, como se demostró en este trabajo con A. flavus y Aspergillus sección Nigri, y lo publicado por Lima et al.15 , y frente a otras especies, como Candida sp y dermatofitos37. Además, Mateo et al. (38, probaron un sistema de embalajes de copolimeros asociados con aceite esencial de orégano y carvacrol, y ambos demostraron eficiencia en controlar el crecimiento de A. flavus y A. parasiticus, así como sobre la producción de aflatoxinas por los mismos.
El eugenol, que también está presente en el aceite esencial de canela (Cinnamomum zeylanicum), mostró en nuestras evaluaciones de medio inoculado frente Aspergillus sección Nigri diferencia significativa en el efecto antifúngico, como tal y en el aceite esencial de canela en comparación con las demás muestras evaluadas y se puede atribuir al eugenol el efecto inhibitorio de la canela, coincidiendo con las observaciones de Trajano et al.24) y Abbaszadeh et al.34.
El aceite esencial de clavo de olor - Eugenia caryophyllata se mostró prometedor con promedios de halos de inhibición que variaron de 10 mm hasta 30 mm, siendo la cepa de Aspergillus sección Nigri más sensible en nuestros ensayos (figura 2 A y B); similares resultados fueron descritos en la literatura21,36,39).
En la evaluación del método de medio inoculado se observó similar perfil de inhibición de crecimiento de Aspergillus sección Nigri cuando comparado con el método de siembra directa, los mayores halos de inhibición se observaron con carvacrol (40 mm) y el aceite de orégano (36 mm) ver figura 2-B.
El método de difusión en agar con discos de papel es considerado un test preliminar muy útil para probar la sensibilidad de microorganismos frente a los productos naturales, se considera el primer ensayo a ser realizado en la evaluación del potencial antimicrobiano, y para servir de guía y base para la elaboración de una secuencia de estudios más detallados28,30,40. En las figuras 3 A y B se observa la comparación de los halos de inhibición entre las dos técnicas de inoculación: siembra directa y medio inoculado frente las dos cepas. No se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los métodos con las diferentes muestras analizadas.
Figura 3 Comparación de los promedios de los halos de inhibición utilizando las dos técnicas de inoculación SD: siembra directa y MI: medio inoculado. A. contra la cepa de A. flavus (CCM-AFMa01). B. contra la cepa de Aspergillus sección Nigri (CCM-ANiMa01). ANOVA two-way, post-test Bonferroni múltiples comparaciones. ns: no son significativamente diferentes (p>0,05).
Siendo así, se puede considerar que los aceites esenciales de Cinnamomum zeylanicum, Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, y los fitoconstituyentes carvacrol y eugenol poseen efecto antifúngico sobre las cepas de A. flavus y Aspergillus sección Nigri cuando son ensayados con las dos modificaciones de la técnica de difusión en agar.
4. CONCLUSIÓN
En este estudio se constató el efecto inhibidor de aceites esenciales y sus fitoconstituyentes mayoritarios sobre el crecimiento fúngico de especies vinculadas a la contaminación de alimentos, y la ausencia de diferencias en tal efecto por el uso de dos técnicas de inoculación en el ensayo de difusión en agar. Los aceites esenciales de canela, clavo de olor, orégano y los metabolitos carvacrol y eugenol ofrecen calidades promisorias para su aplicación en sistemas de conservación de alimentos, si bien se requieren ensayos adicionales, como su influencia en los caracteres organolépticos, para recomendar su empleo a escala productiva.
