INTRODUCCIÓN

El uso de insecticidas convencionales como la fosfina, el malatión y el diclorvos, ha sido la estrategia más utilizada para el control de insectos plaga en granos y productos almacenados, a pesar de la resistencia que inducen en la población de insectos y de los riesgos para la salud humana y el ambiente (^{Campabadal, Maier & Mason, 2013}; ^{Pandiselvam, Sunoj, Manikantan, Kothakota & Hebbar, 2016}). Este hecho ha incentivado la búsqueda de métodos alternativos de control como la aplicación de ozono, el cual ha sido evaluado en estudios de campo y laboratorio, y ha mostrado un efecto tóxico sobre diversas especies de hongos e insectos en granos almacenados (^{Kells, Mason, Maier & Woloshuk, 2001}; ^{Hardin et al., 2010}; ^{Jian, Jayas & White, 2013}).

El ozono (O₃) es un fuerte oxidante utilizado en el tratamiento de agua y en industrias como la farmacéutica y la alimenticia, debido a sus propiedades desodorizantes y desinfectantes (^{Wysok, Uradzinski, Gomólka-Pawlicka, 2006}; ^{Jian et al., 2013}), que le permiten reducir o eliminar la presencia de bacterias, hongos e insectos, y promover la degradación de los residuos de insecticidas (^{Trombete, Freitas-Silva, Saldanha, Venancio & Fraga, 2016}). Entre los atributos de este gas, destacan: (i) su generación in situ de forma eléctrica, lo que elimina la manipulación y almacenamiento de pesticidas; (ii) su rápida degradación a oxígeno molecular sin dejar residuos; y, (iii) no se ha demostrado resistencia al ozono en las especies plaga (^{Işikber & Ӧztekin, 2009}; ^{Sousa, Faroni, Pimentel, Silva & Guedes, 2016}; ^{Sousa, Faroni & Guedes, 2017}).

El efecto tóxico del ozono está asociado a su capacidad para reaccionar con la membrana celular de las bacterias hasta promover la lisis de la célula (^{Wysok et al., 2006}), y en el caso de los insectos, puede afectar el sistema respiratorio y digestivo hasta producir la muerte de estos artrópodos, debido a los daños en los tejidos que resultan en alteración de las tráqueas y ruptura de ADN (^{Pereira, Faroni, Sousa, Urruchi & Paes, 2008}; ^{Rozado, Faroni, Urruchi, Guedes & Paes, 2008}; ^{Pandiselvam et al., 2016}).

Diversos estudios de campo y de laboratorio, indican que la aplicación de ozono ha sido exitosa en el control de especies como Sitophilus oryzae (L.), Rhyzopertha dominica (F.), Tribolium castaneum Herbst y Oryzaephilus surinamensis L., y señalan que la toxicidad del gas ha variado en función de la edad y estado de desarrollo del insecto, tiempo de exposición y concentración del ozono, así como también de la estructura de los silos o contenedores, y de la temperatura y humedad de la masa de granos (^{Hansen, Hansen & Jensen, 2012}; ^{Keivanloo et al., 2014}; ^{Işikber y Athanassiou, 2015}; ^{Pandiselvam et al., 2016}). Una variación importante se produce cuando el ozono es aplicado en contenedores vacíos, donde la mortalidad suele ser mayor debido a que la etapa de saturación del gas se reduce ante la ausencia de granos (^{Kells et al., 2001}; Hansen et al., 2012; ^{Solano, Triana, Ávila, Hernández y Morales, 2017}).

La especie S. oryzae, conocida comúnmente como el gorgojo del arroz, es un insecto de distribución cosmopolita, considerado plaga primaria en granos como el arroz, cebada, maní, maíz, trigo y sorgo, y de productos procesados como harinas, galletas y pastas (^{Alonso Amelot, Ávila Núñez y Calcagno Pisarelli, 2009}). Debido al impacto económico de esta plaga y considerando la importancia del ozono como alternativa de control de insectos, se llevó a cabo el presente estudio con el objetivo de determinar la efectividad del gas para el control del insecto plaga en silos con maíz y vacíos, bajo condiciones de laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención, mantenimiento y cría de S. oryzae

La cría del gorgojo S. oryzae se inició a partir de individuos encontrados en granos de maíz infestado, dispuestos en anaqueles comerciales, los cuales fueron llevados al Laboratorio de Biología y Fisiología Postcosecha del Decanato de Agronomía de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), estado Lara, Venezuela. En el laboratorio, se conformaron 4 grupos de 50 adultos del gorgojo los cuales fueron transferidos a 4 envases de vidrio de 3,8 litros de capacidad, respectivamente. A cada frasco se le colocó 500 gramos de maíz para alimentar a los insectos, y seguidamente se le cubrió con tela organdí para permitir la ventilación y evitar el escape. Estos envases se mantuvieron en una sala de cría a 25 ± 2 °C y 72 ± 10% y 12:12 (L:D) fotoperiodo.

Los adultos de S. oryzae fueron removidos de los envases a los 15 días, después de iniciado el experimento. Posteriormente, los frascos fueron observados semanalmente para conocer el estado de desarrollo de la cría, hasta obtener la F1. Una vez obtenidos los adultos de la F1, se conformaron grupos de 50 individuos, no sexados y con edades comprendidas entre 14 y 21 días.

Determinación de la mortalidad de S. oryzae por efecto del ozono

El experimento fue realizado siguiendo la metodología descrita por ^{Solano et al., (2017}). Se utilizaron prototipos de silos de 592,67 cm³, los cuales contenían 50 adultos de S. oryzae, bajo dos condiciones: silo lleno de maíz y silo vacío. Los granos de maíz utilizados en los experimentos fueron previamente esterilizados a una temperatura de -5°C por un periodo de 1 día. Seguidamente, los granos fueron colocados en una estufa para reducir su humedad a valores comprendidos entre 12 - 14%, lo cual fue comprobado con ayuda de una balanza Steinlite SB 900.

Una vez preparadas las unidades experimentales, se aplicó el ozono a una concentración de 20 ppm durante 15, 30, 45 y 60 minutos, con un tratamiento control donde no se aplicó el gas. La generación de ozono se realizó por medio del método de descarga corona a través de un equipo comercial con una salida de 400 mg h^-1. El gas fue inyectado en la parte superior de los silos con ayuda de una manguera de silicón de 2,5 cm de diámetro y 106 cm de longitud. Una vez instalado el ozonizador, se midió la temperatura de la masa de granos y el interior del silo vacío, la cual fue de 26,27±0,3°C y 25,10±0,4°C, respectivamente. Seguidamente, los silos se sellaron con papel parafilm, para garantizar su hermeticidad.

Una vez finalizado el experimento, los silos (con maíz y vacíos) fueron destapados y los insectos separados en vivos y muertos de acuerdo con el procedimiento descrito por ^{Reza, Asgar & Hasan (2011}). Se consideró a los insectos vivos, cuando éstos mostraron movilidad y comportamiento característico de la especie, mientras que los insectos con detención completa de movimiento o con comportamiento y movimientos descoordinados, fueron considerados muertos. Seguidamente, los insectos de apariencia vivos o muertos fueron colocados de manera separada en envases de vidrio de 30 mL de capacidad con alimento (granos partidos de maíz) y tapados con tela organdí sujetada con una banda de goma para permitir la ventilación y evitar el escape. En estos envases, los insectos fueron mantenidos por un periodo de 24 horas para corroborar su recuperación y/o sobrevivencia. Finalmente, se registró el número de adultos muertos tanto en los silos con maíz como en los vacíos.

El efecto del ozono sobre adultos de S. oryzae, se consideró como una relación directa con el porcentaje de insectos muertos después de 24 horas de la aplicación del gas.

Análisis estadístico

El experimento tuvo un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2x4, donde el primer factor correspondió a la condición de los silos (llenos de granos de maíz o vacíos) y el segundo factor, estuvo representado por los cuatro tiempos de exposición de S. oryzae, al ozono. Se realizaron 4 repeticiones por tratamiento.

Los porcentajes de mortalidad del insecto fueron transformados a arcoseno debido a que presentaron una distribución binomial, y luego se sometieron a análisis estadístico a través del programa Statistix 10.0. Se utilizaron pruebas de comparación de medias LSD con un nivel de confianza de P < 0,01.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El ozono produjo porcentajes de mortalidad sobre adultos de S. oryzae, que variaron significativamente (P<0,001) entre las condiciones de los silos y el tiempo de exposición (Tabla 1). En los silos vacíos, la mortalidad del gorgojo fue significativamente mayor (53,5%) que en los silos llenos de granos de maíz (16,88%) (Figura 1), lo cual coincide con lo señalado por otras investigaciones que indican que el ozono ha sido más efectivo en contenedores vacíos (^{Işikber & Ӧztekin, 2009}; ^{Hansen, et al., 2012}; ^{Hasan, Phillips & Aikins, 2012}; ^{Solano et al., 2017}).

La diferencia en la mortalidad registrada en los silos vacíos y aquellos con maíz puede explicarse por la actividad del gas durante su proceso de ozonificación. De acuerdo con ^{Kells et al. (2001}) y ^{Campabadal et al. (2013}), el ozono aplicado a granos cumple una etapa inicial en la que se desplaza lentamente entre ellos para degradarse al reaccionar con sus superficies. Seguidamente, ocurre la segunda etapa que involucra un movimiento libre del gas entre los espacios intergranarios, en donde se disminuye su tasa de degradación y se incrementa el contacto con los insectos plaga. En este sentido, se infiere que el ozono aplicado a silos vacíos ocasionó mayor mortalidad debido a que la ausencia de granos permitió un contacto directo y efectivo del gas con los insectos.

Figura 1 Mortalidad promedio (%) de adultos de S. oryzae por efecto del ozono en prototipos de silos. Prueba LSD, comparación de rangos de medias (P < 0,01). 

El tiempo de exposición a ozono también produjo un efecto significativo sobre el porcentaje de mortalidad (P<0,001), el cual incrementó con el tiempo y alcanzó su valor más alto a los 60 minutos (58,25%) (Figura 2). La interacción condición de silo por tiempo de exposición a ozono fue significativa (P<0,001) y permitió observar diferencias relevantes en la mortalidad, la cual fue más alta en silos vacíos a los 60 minutos (94%) que en silos con maíz, donde fue considerablemente menor (22,5%) para el mismo período (Figura 3).

Figura 2 Mortalidad promedio (%) de adultos de S. oryzae por efecto de diferentes tiempos de exposición a ozono. Prueba LSD, comparación de rangos de medias (P < 0,01) 

Cuando los gorgojos fueron expuestos a ozono durante 30 y 45 minutos, la mortalidad fue estadísticamente similar para silos vacíos (48 y 47,5%) y silos con maíz (15 y 17%), respectivamente. No obstante, estos valores difirieron entre ambas condiciones de silo. A los 15 minutos de exposición, el porcentaje de mortalidad en silos vacíos fue mayor (24,5%) que en silos con maíz (13%). ^{Keivanloo, Namaghi & Haddad (2014}) registraron valores de mortalidad similares cuando aplicaron ozono a una concentración de 5 ppm en contenedores vacíos, durante 90 y 120 minutos, en larvas (78,33 y 85%) y pupas (65 y 80%) de Plodia interpunctella (Hübner), respectivamente.

Los factores como presencia de granos de maíz, tiempo de exposición y concentración del ozono, pudieron haber influido en los bajos porcentajes de mortalidad registrados para S. oryzae en silos con maíz. El primero de los factores implicó que el ozono se degradara en la superficie de los granos, antes de proseguir su desplazamiento entre ellos, mientras que los tiempos de exposición y la concentración pudieron ser insuficientes para que el gas alcanzara la etapa de saturación e iniciara su libre diseminación para tener contacto efectivo con los insectos, toda vez que se ha registrado que el ozono aplicado sobre maíz, requiere al menos de 70 minutos para saturar los granos cuando se aplica a una concentración de 110 ppm (^{Dos Santos et al., 2007}).

Figura 3 Mortalidad promedio (%) de adultos de S. oryzae por efecto de diferentes tiempos de exposición a ozono y la condición de silos. Prueba LSD, comparación de rangos de medias (P < 0,01) 

^{Mason, Woloshuk & Maier (1997}) e ^{Işikber y Ӧztekin (2009}) indicaron que la eficiencia del ozono puede incrementarse con un reflujo intermitente en la masa de granos que permita mantener la concentración del gas, o con la realización de dos aplicaciones; de modo que la primera permita que el ozono reaccione con la superficie de los granos, y la segunda que el gas sea más efectivo contra los insectos. La acción insecticida del ozono también puede variar en función de la ausencia o presencia de granos, tipo de grano y espacios intergranarios, temperatura y humedad de la masa de granos, y velocidad y concentración del flujo de ozono (^{Kells et al., 2001}; ^{Faroni et al., 2007}; Işikber & Athanassiou, 2015).

Otras investigaciones han indicado que especies como S. oryzae, S. zeamais y S. granarium, han mostrado susceptibilidad al ozono en sus diferentes estados de desarrollo, alcanzando niveles de mortalidad de 50 a 100%, con concentraciones que han variado entre 35 a 135 ppm, aplicadas durante 4 a 8 días en sistemas que incluían inyección y extracción del gas (^{Rozado et al., 2008}; ^{Hansen et al., 2012}).

CONCLUSIÓN

La concentración de ozono de 20 ppm aplicada en silos metálicos herméticos fue efectiva en producir mayor mortalidad de S. oryzae en los silos vacíos que en aquellos con maíz, en todos los tiempos de exposición evaluados. La presencia de los granos de maíz, la concentración del ozono y el poco tiempo de exposición, son factores que pudieron influir en la baja mortalidad del gorgojo en los silos con maíz.