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INTRODUCCIÓN
La resistencia antimicrobiana (RAM) es considerada actualmente como la pandemia silenciosa, causante de muchas muertes y elevados costos en la atención sanitaria. Hacer frente a esta pandemia es aún más complicada debido a la gran capacidad que poseen los microorganismos de desarrollar y propagar nuevos mecanismos de resistencia y a la cada vez más escasa disponibilidad de nuevos fármacos para combatir este flagelo1.
La emergencia de los microorganismos resistentes a los antimicrobianos se vio favorecida por la pandemia ocasionada por la COVID-19; constituyéndose en una de las principales preocupaciones para todos los establecimientos de salud por las consecuencias que producen2,3.
Según comunicado de prensa de la Organización Mundial de la Salud (OMS); de fecha 26 de abril de 2024; se demostró que durante la última pandemia se hizo uso excesivo de antibióticos en los pacientes hospitalizados por COVID-19, de manera generalizada en todo el mundo, lo cual pudo haber exacerbado la propagación «silenciosa» de la resistencia a los antimicrobianos4.
A fin de promover la investigación y desarrollo de nuevos tratamientos, necesarios para frenar la propagación de la RAM, la OMS publicó en el año 2017 y actualizó en mayo del 2024, una lista de patógenos bacterianos resistentes a los antibióticos clasificadas en tres categorías (crítica, alta y media) para facilitar el establecimiento de prioridades, en base a la necesidad de obtener nuevos antibióticos que son necesarios para frenar la propagación de resistencias a los antimicrobianos5.
En Paraguay, los bacilos gramnegativos resistentes a los carbapenémicos por producción de carbapenemasa representan un severo problema en los hospitales. Durante la pandemia por COVID-19 la mayoría de los laboratorios de Microbiología notificaron un incremento en el número de aislamientos de este tipo de microorganismos, además de confirmarse la doble producción de carbapenemasas en algunos grupos bacterianos como Acinetobacter baumannii y Enterobacterales1,6,7.
Los trabajos de vigilancia laboratorial son cruciales para la detección de mecanismos inusuales y emergentes de resistencia. En Paraguay, tenemos constituida la Red de Vigilancia Laboratorial de la Resistencia a los Antimicrobianos (RAM) Paraguay, que fue aprobada por Resolución del Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social (Resolución S.G. N° 123/2024), quedando establecido de manera legal el trabajo llevado a cabo en el país desde el año 19978.
Los objetivos de la realización del presente trabajo fueron:
General:
Caracterizar genotípicamente las carbapenemasas de los bacilos gramnegativos de importancia clínica aislados en los distintos hospitales de Paraguay durante el 2022 y relacionar con la sensibilidad a la colistina de las bacterias en estudio.
Específicos:
Conocer las bacterias resistentes a carbapenémicos circulantes en hospitales del país.
Determinar los genotipos de carbapenemasas de las cepas remitidas.
Precisar el origen (tipo de muestra clínica) de los aislamientos.
Conocer el rango etario de los pacientes de quienes fueron aisladas las bacterias en estudio.
METODOLOGÍA
Estudio retrospectivo, observacional, descriptivo de corte transversal realizado en aislamientos de bacilos gramnegativos provenientes de 24 centros colaboradores de la Red de Vigilancia Laboratorial de la RAM, remitidos al Laboratorio Central de Salud Pública (LCSP) entre enero y diciembre de 2022, para estudio de resistencias inusuales (estudios fenotípicos y genotípicos para confirmación de portación de carbapenemasas y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana).
Los criterios de derivación de las cepas fueron:
En Enterobacterales:
Halo de inhibición de imipenem ≤ 22 mm, o
Concentración inhibitoria mínima (CIM) en equipo automatizado (Vitek®2 C) de imipenem ≥ 2 ug/mL9.
En Pseudomonas aeruginosa:
Halos de inhibición de ceftazidima ≤ 22 mm y meropenem ≤ 23 mm, o
CIM en equipo automatizado (Vitek®2 C) de imipenem ≥ 2 ug/mL + meropenem ≥ 1 ug/ml + ceftazidima ≥ 16 ug/mL10.
En Acinetobacter spp.:
Halo de inhibición de imipenem ≤ 22 mm o meropenem ≤ 18 mm, o
CIM en equipo automatizado (Vitek®2 C) de imipenem ≥ 4 ug/ml11.
Aislamientos bacterianos evaluados
Fueron estudiados un total de 1226 aislamientos remitidos, 629 correspondieron a bacilos gramnegativos no fermentadores (BGNNF) y 597 a fermentadores (BGNF).
Las identificaciones de los mismos fueron llevadas a cabo por pruebas bioquímicas manuales, automatizadas Vitek®2 Compact (BioMérieux, Francia) y genotípicas (detección de bla OXA-51-like en Acinetobacter spp.).
Tamizaje fenotípico de la producción de carbapenemasas:
Fue realizado por el test colorimétrico rápido blue carba12, y las sinergias entre los discos de carbapenémicos, ceftazidima/avibactam y aztreonam con los de ácido fenilborónico (APB) y ácido etilen-diamino-tetra-acético/ácido mercapto-acético de sodio (EDTA/SMA).
Estudio genotípico para la detección de genes de resistencia:
Realizado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple de punto final.
Para los BGNF se utilizó el protocolo validado por el Laboratorio Regional de Referencia INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán de Argentina para detección de los genes bla KPC, bla NDM, bla IMP, bla VIM y bla OXA-48-like13. Para los BGNNF fueron utilizados los protocolos de detección de los genes bla KPC, bla NDM, bla IMP, bla VIM y bla SPM (Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp.) también validado por el Laboratorio Regional de Referencia y de detección de los genes bla OXA-like (bla OXA-51 , bla OXA-23 , bla OXA-24 , bla OXA-58) en Acinetobacter spp. validado por Woodfor Neil y colaboradores14.
Además, fue evaluada la portación del gen mcr, para la resistencia plasmidíca a polimixinas, en todos los aislamientos estudiados15.
Para la obtención del ADN se utilizó el método de lisis bacteriana por ebullición durante 10 minutos de una suspensión bacteriana de aproximadamente 0,5 Mac Farland en 300 uL de agua libre de RNAsa y centrifugada posteriormente a 10.000 rpm por 10 minutos Las reacciones de amplificación de los genes se realizaron en un termociclador TC-PRO (BOECO Germany) y los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % en tampón TAE buffer (PanReac AppliChem - ITW Reagents). Las imágenes de los patrones electroforéticos fueron obtenidas con el equipo fotodocumentador Gel Doc TM EZ Imager (BIO-RAD) y analizadas con el programa Image Lab 6.0 (BIO-RAD).
Estudio de la susceptibilidad a colistina:
Se llevó a cabo por microdilución en caldo, en el rango de concentración 0,25 a 8 ug/mL. Para la interpretación de los resultados se utilizó el Consenso Latinoamericano para definir, categorizar y notificar patógenos multirresistentes, con resistencia extendida o pan-resistentes16.
Consideraciones éticas
El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Laboratorio Central de Salud Pública del Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social, Dictamen CEI-LCSP N° 254/2024.
RESULTADOS
Del total de 1226 aislamientos estudiados, 629 correspondieron a BGNNF y 597 a BGNF (Tabla 1); de los cuales 1127 fueron portadores de carbapenemasas.
Tabla 1: Aislamientos bacterianos remitidos para confirmación de resistencias inusuales. Sección Antimicrobianos - LCSP. Paraguay. Año 2022. (n = 1226)
Fuente: Sección Antimicrobianos. Dpto. Bacteriología y Micología. Laboratorio Central de Salud Pública
Los microorganismos en los que fueron confirmadas la producción de carbapenemasa se detallan en la Tabla 2.
Tabla 2: Tipo de bacterias productoras de carbapenemasa confirmadas en la Sección Antimicrobianos - LCSP. Paraguay. Año 2022. (n = 1127)
| Microorganismo/grupo de microorganismos | N° de aislamientos |
|---|---|
| Acinetobacter baumannii | 550 |
| Enterobaterales | 548 |
| P. aeruginosa | 29 |
| Total | 1127 |
Fuente: Sección Antimicrobianos. Dpto. Bacteriología y Micología. Laboratorio Central de Salud Pública.
En cuanto a los aislamientos de A. baumannii, de los 552 aislamientos estudiados, 550 fueron resistentes a los carbapenémicos, y todos ellos portadores de carbapenemasas (CBP). Los genotipos confirmados están detallados en el Gráfico 1.
Gráfico 1: Genotipos de carbapenemasas en Acinetobacter baumannii de hospitales de Paraguay, confirmados en el LCSP por PCR convencional múltiple. Año 2022, (n = 550)
El 65,5 % de las cepas de A. baumannii productores de carbapenemasa fueron recuperados de pacientes del sexo masculino y el 34,5 % del sexo femenino. La distribución por rango etario está resumida en el Gráfico 2.
Gráfico 2: Rango etario de los pacientes con Acinetobacter baumannii productores de carbapenemasa. Año 2022 (n = 550)
El origen de los aislamientos de A. baumannii productores de carbapenemasa fue muy diverso, pero el sitio de recuperación prevalente fue el respiratorio. Grafico 3.
Gráfico 3: Origen de aislamientos de Acinetobacter baumannii productores de carbapenemasa. Año 2022 (n = 550)
En cuanto a la susceptibilidad a la colistina; el 98 % de los aislamientos de A. baumannii productores de carbapenemasa arrojaron CIM ≤ 2 ug/mL (sensibles).
Del total de Enterobacterales (597); fueron confirmados como productores de carbapenemasa 548 aislamientos, siendo Klebsiella pneumoniae el microorganismo prevalente (78 %), seguido de Enterobacter cloacae complex (7 %) y Escherichia coli (7 %), entre otros; provenientes en su mayoría de pacientes del sexo masculino (66 %), cuyo rango etario está distribuido según lo resumido en el Gráfico 4.
Gráfico 4: Rango etario de pacientes con Enterobacterales productores de carbapenemasa. Año 2022 (n = 548)
Los orígenes de los aislamientos de Enterobacterales productores de carbapenemasa fueron: orina (45 %), muestras respiratorias (21 %), sangre (15 %), secreciones purulentas (10 %), entre otros. Los genotipos de carbapenemasa confirmados en estos microorganismos se presentan en el Gráfico 5.
En cuanto a la prueba de susceptibilidad a la colistina, el 76 % de los aislamientos de K. pneumoniae productores de carbapenemasa arrojaron CIM ≤ 2 ug/mL (sensibles) y el 24 % tuvieron la CIM ≥ 4 ug/mL (resistentes). Todos ellos resultaron ser negativos para la portación del gen mcr.
Gráfico 5: Genotipos de carbapenemasas en Enterobacterales resistentes a carbapenémicos, confirmados por PCR convencional múltiple. Año 2022 (n = 548)
De los 55 aislamientos de Pseudomonas aeruginosa resistentes a los carbapenémicos, 71 % provinieron de pacientes de sexo masculino y 21 % de sexo femenino; cuyo rango etario se ilustra en el Gráfico 6.
En cuanto al origen de los aislamientos, 45 % fueron de muestras respiratorias, 31 % de orina, 15 % de sangre y 9 % de secreciones.
De estos, 29 resultaron ser productores de carbapenemasa, cuyos genotipos pueden visualizarse en el Gráfico 7.
Gráfico 6: Rango etario de los pacientes con Pseudomonas aeruginosa resistentes a los carbapenémicos. Año 2022. (n = 55)
Gráfico 7: Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos. Genotipificación de carbapenemasas por PCR convencional múltiple. Año 2022. (n =55)
Según los resultados de la prueba de susceptibilidad a la colistina para todos los aislamientos de P. aeruginosa resistentes a los carbapenémicos, el 96 % presentó la CIM ≤ 2 ug/mL (sensibles) y el 4 % con CIM ≥ 4 ug/mL (resistentes). Todos ellos resultaron negativos para la portación del gen mcr.
DISCUSIÓN
Uno de los mayores desafíos de los servicios de salud es la lucha contra las infecciones asociadas a la atención de la salud (IAAS); siendo los gérmenes resistentes a carbapenémicos por producción de carbapenemasas; que por su gran capacidad de diseminación; dificultan aún más las tomas de las medidas de contención.
En nuestro país, la circulación de estos gérmenes se registra en todos los hospitales, de pequeña, mediana y alta complejidad, desde el año 2009 (KPC) y 2012 (NDM) 17,18.
El trabajo de vigilancia de la RAM, coordinado por el Laboratorio de Referencia Nacional (LCSP) es de gran importancia, pues permite mejorar la capacidad de detección de los diversos mecanismos de resistencia a los antimicrobianos por los laboratorios de microbiología del sistema de salud; generando de esa manera información valiosa sobre la epidemiología de los microorganismos resistentes circulantes en el país. Estos conocimientos permiten orientar a las autoridades sanitarias a la implementación de políticas de salud y adquisición de los medicamentos correctos.
En el año 2021, en plena pandemia por COVID-19, llevamos a cabo la caracterización molecular de las carbapenemasas en los bacilos gramnegativos de importancia médica, recuperados entre enero y abril del mismo año19; y al comparar con éste estudio, llevado a cabo con aislamientos durante el año 2022, se pudo observar que a pesar de la gran diferencia en el número de cepas bacterianas evaluadas, el patrón de los hallazgos fue el mismo, tanto para Enterobacterales (predominio de NDM), Acinetobacter baumannii (predominio de OXA-23) y Pseudomonas aeruginosa (predominio de NDM). La coproducción de enzimas, también confirmada durante la pandemia en nuestro país20, fue encontrada en Enterobacterales y A. baumannii; no así en P. aeruginosa.
En concordancia con nuestros hallazgos, una revisión publicada en el 2017 por Rodríguez C. y colaboradores sobre las carbapenemasas en A. baumannii diseminadas en Latinoamérica revela que la enzima OXA-23 es la prevalente en este microorganismo21.
Otros investigadores latinoamericanos, como Kiffer CRV y colaboradores, en el 2023 divulgaron los resultados de un estudio de la perspectiva nacional brasileña de 7 años sobre la resistencia a carbapenémicos mediada por plásmidos en Enterobacterales,Pseudomonas aeruginosayAcinetobacter baumanniicomplex; con resultados similares a los nuestros en Enterobacterales, en los que se observa que el genotipo NDM va en aumento en contraposición con el KPC, y el predominio de OXA-23 en Acinetobacter baumannii; sin embargo, describieron genotipos que en nuestro país no fueron confirmados en ciertas especies, como KPC y SPM en P. aeruginosa, IMP y VIM en Enterobacterales y KPC, IMP y VIM en A. baumannii22.
En Argentina, en un estudio en Enterobacterales llevado a cabo por Giletto, G y colaboradores, entre el 2020 y 2021 en la ciudad de Mar del Plata, encontraron que en el 2000 el genotipo prevalente fue KPC, mientras que en el 2021 fue OXA-163 con la aparición de las cepas dobles productoras de carbapenemasa23.
Publicaciones realizadas por diversos investigadores revelan la gran diversidad en la epidemiología de la resistencia a los carbapenémicos y de las enzimas carbapenemasas; por lo que es muy importante la vigilancia epidemiológica local, que garanticen la detección oportuna de mecanismos de resistencia de rápida diseminación y la toma de medidas para la contención de la propagación de los mismos.
Durante la pandemia de COVID-19 varios países, incluyendo el nuestro, reportaron el incremento de bacterias productoras de carbapenemasas, así como también la coproducción de las mismas24-28; producto del uso indiscriminado de antimicrobianos de amplio espectro en la terapia empírica de probables infecciones bacterianas asociadas29.
En Paraguay; donde la resistencia de los microrganismos a los antimicrobianos de amplio espectro, como los carbapenémicos, sumada a la escasez de nuevas drogas más eficaces; en los últimos años generó la necesidad de recurrir a la colistina, cuyo uso fue limitado por mucho tiempo por su toxicidad y su difícil manejo para el tratamiento de las enfermedades infecciosas ocasionadas por estos microorganismos.
El estudio de la susceptibilidad a la colistina y la detección de los mecanismos de resistencia a esta droga, representan un desafío para los laboratorios de microbiología, ya que para ello son necesarias metodologías más complejas30.
Los resultados obtenidos con las cepas estudiadas revelaron que el 24 % de los aislamientos de K. pneumoniae productoras de carbapenemasa fueron resistentes a la colistina; sin embargo, en A. baumannii productoras de carbapenemasa solo el 2 % fueron resistentes.
Por la relevancia que tienen los aislamientos de P. aeruginosa resistentes a los carbapenémicos por mecanismos distintos a la producción de enzimas carbapenemasas (47,3 %), la susceptibilidad a la colistina fue evaluada en la totalidad de las cepas resistentes (n = 55), resultando resistentes el 4 % de los mismas. El bajo número de cepas evaluadas podría generar sesgo en los resultados obtenidos.
La evaluación de portación del gen mcr resulto negativa para todos los aislamientos, lo cual sugiere que la resistencia a esta droga esta mediada por mecanismo no transferible, como las mutaciones cromosómicas originadas por la presión de selección producida por el aumento de su utilización.
Recientemente, un grupo de investigadores de Vietnam obtuvo hallazgos similares a los nuestros, al evaluar la resistencia a colistina en K. pneumoniae resistente a carbapenémicos por producción de carbapenemasa, encontrando un 23,3 %31; mientras que, en Perú, Naomi-Matsuoka y colaboradores, en un estudio llevado a cabo con aislamientos del 2018 en K. pneumoniae multidrogorresistente, encontraron resultados más elevados (33,3 %)32.
Estos altos porcentajes de resistencia a la colistina del principal patógeno hospitalario (K. pneumoniae), deja sin opciones terapéuticas disponibles en el país, para el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Debido a ello, urge la necesidad de contar con drogas nuevas y efectivas, que garanticen el éxito terapéutico; como así también políticas de uso racional de antimicrobianos en todos los sectores.
CONCLUSIÓN
En Enterobacterales y Pseudomonas aeruginosa, la carbapenemasa prevalente es la metalo-β-lactamasa NDM y en Acinetobacter baumannii la oxacilinasa OXA-23.
En P. aeruginosa, casi la mitad de los aislamientos resistentes a los carbapenémicos no producen carbapenemasa, siendo probablemente impermeabilidad y/o eflujo los mecanismos involucrados.
La coproducción de enzimas carbapenemasas está presente en Enterobacterales (NDM+KPC y NDM+OXA-48 like) y A. baumannii (OXA-23+NDM+OXA-58).
K. pneumoniae y A. baumannii son los microorganismos prevalentes; recuperados en su mayoría de pacientes de sexo masculino, mayores de 60 años, de muestras de orina y respiratoria respectivamente. P. aeruginosa, recuperado mayoritariamente de muestras respiratorias de pacientes de sexo masculino, mayores de 60 años.
La resistencia a colistina es más frecuente en Enterobacterales (K. pneumoniae) que en A. baumannii y P. aeruginosa, resistentes a carbapenémicos.
