Spanish (pdf)
Article in xml format
Article references
Automatic translation
Send this article by e-mail
Cited by SciELO 
Similars in
SciELO 
Permalink
INTRODUCCIÓN
La toxoplasmosis es una enfermedad zoonótica1,2 que tiene como agente causal al Toxoplasma gondii (T. gondii), cuyo huésped definitivo son los felinos. T. gondii es un parásito intracelular obligado capaz de infectar a una gran variedad de hospedadores vertebrados. Se transmite por la ingestión de ooquistes presentes en las heces de felinos, la ingestión de quistes tisulares de T. gondii contenidos en tejidos de animales con infección crónica y por vía transplacentaria2-4.
La infección por T. gondii en perros no solo tiene relevancia desde el punto de vista epidemiológico, sino también desde el clínico. El perro doméstico al ser un huésped intermediario del parásito, puede adquirir la forma infectante al entrar en contacto con heces de gatos o con comportamientos de coprofagia. Las personas entran en contacto con sus mascotas a través de caricias, exponiéndose al parásito que puede estar presente en la superficie corporal, la boca y las patas del canino5. Esta patología generalmente no presenta signos asociados en perros, sin embargo, pueden observarse manifestaciones clínicas en animales inmunodeprimidos o que presentan comorbilidades6,7.
Comprender la dinámica de la infección en los perros también implica tener en cuenta las características del parásito involucrado. El Toxoplasma gondii presenta una diversidad genética variable, ya que existen factores que podrían contribuir a la modificación genética8. Se clasificó inicialmente en los tipos I, II y III, donde el tipo I (cepa RH) se reconoce como virulento en ratones, mientras que los tipos II (NTE) y III se consideran avirulentos, pero esta tipificación evolucionó con el hallazgo de cepas atípicas, especialmente en América del Sur. En Brasil se identificaron cepas como BrI, BrII, BrIII, BrIV, además de otras exóticas como Tipo 12, África 1 y China 1. Las cepas atípicas se relacionan con la manifestación severa de la patología, la toxoplasmosis multivisceral y una alta tasa de mortalidad en pacientes inmunocompetentes8-11.
Esta variabilidad genética no solo determina la virulencia del parásito, sino también su distribución geográfica. En América del Sur T. gondii adquiere especial relevancia debido a su marcada diversidad genética, reflejada en las altas tasas de seroprevalencia reportadas en países como Chile (55,9%), Brasil (70-81%), Argentina (21,2%) y Paraguay (63-84%)1,9,12-14. En Brasil se tiene evidencia sobre cepas atípicas que son las que principalmente causan la infección a sus hospedadores. Sin embargo, en Paraguay aún no se han reportado sobre las cepas circulantes en la región y su prevalencia.
La toxoplasmosis presenta una alta prevalencia en Paraguay, y la severidad clínica en humanos y las estrategias terapéuticas dependen de la cepa infectante, por lo que resulta fundamental conocer las variantes circulantes en la región. Dado que los caninos están en constante contacto con el ambiente, constituyen posibles reservorios y portadores de distintas cepas del parásito. En este contexto, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la concordancia y el desempeño diagnóstico del ELISA in-house con antígenos de las cepas RH y NTE frente a un ELISA comercial con la proteína p30 (SAG1) de antígeno, constituyendo un primer acercamiento para determinar si la respuesta serológica de los caninos difiere entre cepas locales y el antígeno recombinante, y proporcionar evidencia preliminar sobre la utilidad de estos antígenos en estudios de vigilancia serológica de la toxoplasmosis.
MATERIAL Y MÉTODOS
Diseño del estudio y selección de muestras
Se realizó un estudio observacional analítico de corte transversal. Los 96 sueros caninos empleados en este estudio pertenecen a la seroteca del Departamento de Producción del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS-UNA). Estas muestras fueron sometidas previamente a un análisis de toxoplasmosis mediante un test comercial multiespecie IDVET (ID Screen® Toxoplasmosis Indirect Multi-species) en el Laboratorio CEVIDEP-San Lorenzo y posteriormente donadas al Dpto. de Producción-IICS-UNA. El muestreo aplicado fue de tipo probabilístico por conveniencia. Se incluyeron los sueros de pacientes caninos positivos y negativos para toxoplasmosis, diagnosticado por el ELISA comercial multiespecie.
Las muestras procedían de perros domésticos atendidos en clínicas veterinarias del área metropolitana de Asunción y ciudades aledañas. Se incluyeron animales con diagnóstico previo positivo y negativo por el test comercial, sin distinción de sexo ni edad. Se excluyeron muestras hemolizadas o con volúmenes insuficientes.
ELISA indirecto in house
Se utilizaron ratones albinos suizos para la producción de antígeno a partir de taquizoítos criopreservados de dos cepas de Toxoplasma gondii (RH y NTE). Los taquizoítos fueron homogeneizados mediante sonicación para obtener un antígeno soluble. Para los ensayos serológicos, las placas de ELISA fueron sensibilizadas con 1 µg de antígeno soluble por pocillo para la cepa RH y 2 µg por pocillo para la cepa NTE, empleando una solución tampón carbonato con antígeno a partir de 1 mg/mL para la cepa RH y 36,8 mg/mL para la cepa NTE. Este antígeno se utilizó posteriormente en el ensayo ELISA in-house para evaluar la respuesta serológica en muestras caninas.
Los 96 sueros caninos fueron analizados en una dilución de 1:40, empleando 50 µL por pocillo. Se incorporó un pool de sueros positivos y negativos como controles internos. Tras incubación a 37 °C durante 1 h y tres lavados consecutivos con tampón de lavado, se adicionó conjugado anti-IgG canino marcado con peroxidasa, en diluciones de 1:10.000 para la cepa RH y 1:1.000 para la cepa NTE. Posteriormente, se realizó una segunda incubación seguida de lavado, y se agregaron 100 µL de sustrato cromogénico por pocillo. La lectura de absorbancia se efectuó a 405 nm a los 20, 30 y 40 minutos, ajustando el tiempo según la intensidad del desarrollo cromogénico.
El ELISA comercial IDVET (ID Screen® Toxoplasmosis Indirect Multi-species) es un ensayo inmunoenzimático indirecto diseñado para detectar anticuerpos IgG específicos contra Toxoplasma gondii en diferentes especies animales (rumiantes, cerdos, perros, gatos), utilizando un solo kit comercial. Su fundamento se basa en el principio clásico del ELISA indirecto: los pocillos de la microplaca están sensibilizados con la proteína P30 (antígeno SAG1) del parásito, una de las proteínas de superficie más inmunogénicas y conservadas de T. gondii, que induce una respuesta humoral robusta en huéspedes infectados.
Asuntos estadísticos
Se calcularon las frecuencias de las variables demográficas de los caninos, incluyendo sexo, edad y raza. El nivel de concordancia entre los métodos se determinó mediante la índice kappa de Cohen15, considerando un nivel de confianza del 95% y significancia estadística de p < 0,05, tanto para la cepa RH como para la cepa NTE. Además, se calcularon los indicadores de desempeño diagnóstico del ELISA in-house con antígenos de las cepas RH y NTE en comparación con el ELISA comercial de proteína p30, incluyendo sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN). El procesamiento estadístico de los datos se realizó utilizando el programa EPIDAT 4.2. y 3.1.
Asuntos éticos
Este estudio fue aprobado por los comités de ética de la FCQ-UNA (código 1107/2024) y del IICS-UNA (código P19/2023). Los sueros codificados, almacenados en la seroteca del IICS-UNA, forman parte de un proyecto previamente aprobado (código P12/2023) para el desarrollo del ELISA para caninos. Todos los análisis fueron realizados únicamente por los investigadores, sin generar impacto negativo sobre los animales, que ya contaban con diagnóstico previo.
RESULTADOS
Se analizaron 96 sueros caninos, de los cuales 42 (43,75%) corresponden a hembras y 54 (56,25%) a machos. Respecto a la raza, 35 (36,46%) eran mestizos y 61 (63,54%) pertenecían a otras razas. En cuanto a la edad, 69 (71,88%) eran adultos, 4 (4,16%) cachorros y 23 (23,96%) carecían de información.
La frecuencia de reacción positiva ante Toxoplasma gondii fue de 39 (40,62%) para la cepa RH y de 21 (21,88%) para la cepa NTE. Las absorbancias promedio (DO+/-DS) a los 30 minutos fueron: 0,535+/-0,594 para RH (DO control positivo=1,462+/-0,276; DO control negativo=0,261+/-0,118) y 0,365+/-0,276, para NTE (DO control positivo=0,589 +/- 0,107; DO control negativo=0,264+/-0,107).
Se evaluó la concordancia y correlación entre ambas cepas (Tabla 1), observándose una concordancia moderada (Kappa=0,4876) con significancia estadística (p=0,00001). De las 96 muestras, 22 presentaron resultados discordantes: 20 fueron positivas para RH y negativas para NTE, mientras que 2 fueron positivas para NTE y negativas para RH.
Tabla 1. Concordancia de reacción serológica entre cepas RH y NTE por el método de ELISA in house indirecto.
| Cepa NTE | ||||
|---|---|---|---|---|
| Positivos n(%) | Negativos n(%) | Total n(%) | ||
| Cepa RH | Positivos | 19(19,79) | 20(20,83) | 39(40,62) |
| Negativos | 2(2,08) | 55(57,29) | 57(59,38) | |
| Total | 21(21,88) | 75(78,12) | 96(100) | |
Kappa=0,4876; IC95% (0,3182-0,6571); p=0,00001
Se observó una correlación alta entre las densidades ópticas de las cepas evaluadas, con un coeficiente de correlación de 0,692 con una p=0,001 (Figura 1).
Figura 1. Gráfico de dispersión. Densidades ópticas obtenidas en sueros frente a las cepas RH y NTE del T. gondii, medidas en el ELISA in house indirecto.
En la Tabla 2 se presentan los resultados de la comparación entre la cepa RH y la proteína p30. La concordancia entre la proteína p30 recombinante del ELISA comercial IDVET (ID Screen® Toxoplasmosis Indirect Multi-species) y el antígeno de la cepa RH del ELISA in-house desarrollado en este estudio fue moderada (Kappa = 0,5089) y estadísticamente significativa (p=0.00001). De las 96 muestras incluidas, 11 sueros resultaron positivos para la cepa RH pero negativos para la proteína p30. En cuanto a los indicadores de desempeño diagnóstico del ELISA in-house con antígeno de la cepa RH en comparación con el ELISA comercial de proteína p30, la sensibilidad fue de 71,79%, la especificidad de 80,70%, el valor predictivo positivo (VPP) de 71,79% y el valor predictivo negativo (VPN) de 80,70%.
Tabla 2. Concordancia y desempeño diagnóstico del ELISA in-house (cepa RH) frente al ELISA comercial multiespecie con proteína p30.
| Multiespecie (p30) | ||||
|---|---|---|---|---|
| Positivos n (%) | Negativos n (%) | Total n (%) | ||
| Cepa RH | Positivos | 28(29,17) | 11(11,46) | 39(40,62) |
| Negativos | 11(11,46) | 46(47,92) | 57(59,38) | |
| Total | 39(40,62) | 57(59,38) | 96(100) | |
K=0,5250 IC95% (0,3516-0,6983); Sensibilidad: 71,79% IC95% (56,39%-87,20%); Especificidad: 80,70% IC95% (69,58%-91,82%); VPP: 71,79% IC95% (56,39%-87,20%); VPN: 80,70% IC95% (69,58%-91,82%)
La comparación entre la respuesta ante la proteína p30 y el antígeno de la cepa NTE mostró una concordancia débil (Kappa = 0,2082), aunque estadísticamente significativa (p = 0,0247). Se analizaron 96 muestras, 8 sueros resultaron positivos para la cepa NTE y negativos para la proteína p30 (Tabla 2 , Tabla 3). El análisis de desempeño diagnóstico del ELISA in-house con antígeno de la cepa NTE frente al ELISA comercial reveló una sensibilidad del 33,33%, especificidad del 85,96%, valor predictivo positivo (VPP) del 61,90% y valor predictivo negativo (VPN) del 65,33%.
Tabla 3. Concordancia y desempeño diagnóstico del ELISA in-house (cepa NTE) frente al ELISA comercial multiespecie con proteína p30.
| Multiespecie (p30) | ||||
|---|---|---|---|---|
| Positivos n (%) | Negativos n (%) | Total n (%) | ||
| Cepa NTE | Positivo | 13(13,54) | 8(8,33) | 21(21,88) |
| Negativo | 26(27,08) | 49(51,04) | 75(78,12) | |
| Total | 39(40,62) | 57(59,38) | 96(100) | |
K=0,2082 IC95% (0,0228-0,3935); Sensibilidad: 33,33% IC95% (17,26%-49,41%); Especificidad: 85,96% IC95% (76,07%-95,86%); VPP: 61,90% IC95% (38,75%-85,06%); VPN: 65,33% IC95% (53,9%-76,77%)
DISCUSIÓN
Este estudio aporta datos sobre la frecuencia de IgG positivos para T. gondii en 96 caninos, fue de 39 (40,62%) para la cepa RH (linaje tipo I) y de 21 (21,88%) para la cepa NTE (linaje tipo II). Las cepas del linaje tipo I, como RH, se caracterizan por su alta virulencia y una dosis letal de 100 con un solo parásito viable en modelos murinos, asociándose principalmente a casos graves de toxoplasmosis congénita16.
Diversos estudios moleculares han demostrado que en América del Sur y Centroamérica predomina el linaje tipo III10, aunque existe marcada diversidad genética regional: en Brasil circulan linajes atípicos BrI–BrIV17; en Argentina predomina el tipo III; en Uruguay, el tipo I; en Perú y Colombia, el BrIV; y en Chile, una variante del tipo II10. En este contexto, las diferencias de reactividad observadas entre RH y NTE en una misma muestra podrían atribuirse a variaciones genéticas que afectan la expresión de proteínas asociadas a virulencia y evasión inmune, modificando la presentación antigénica y la detección de anticuerpos por ELISA18.
Se observó concordancia moderada y significativa entre la cepa RH del ELISA in house y la proteína p30 recombinante del ELISA comercial multiespecie, mientras que la comparación con la cepa NTE mostró concordancia débil pero significativa. Estas diferencias reflejan que ambos métodos detectan anticuerpos relacionados, pero con distinta intensidad, lo cual podría deberse a la variabilidad antigénica entre cepas virulentas y avirulentas, y a que p30 representa un único antígeno recombinante.
De las 96 muestras analizadas, algunas resultaron positivas para RH o NTE y negativas para p30, lo que indica que la sensibilidad del ELISA in house puede diferir de la obtenida con antígenos recombinantes simples, y que los métodos basados en antígenos del parásito completo pueden generar reacciones cruzadas19-21. Estudios recientes con antígenos quiméricos que combinan fragmentos inmunodominantes de SAG1 (p30) y SAG2 han demostrado un mejor desempeño diagnóstico. SAG1 es la principal proteína de superficie del taquizoíto, altamente conservada e inmunodominante, mientras que SAG2 también participa en la interacción parásito–hospedador y presenta variaciones antigénicas entre linajes. La combinación de epítopos de ambas proteínas amplía el reconocimiento serológico, aumentando la sensibilidad y especificidad en comparación con antígenos individuales o lisados totales. Según Liyanage et al.20, los ensayos que emplean antígenos recombinantes múltiples o quiméricos muestran mayor concordancia y menor reactividad cruzada que los basados en parásito completo.
La alta variabilidad genética de T. gondii en América del Sur puede explicarse por reinfección derivada de la caza de hospedadores definitivos y recombinación genética subsiguiente, lo que sugiere que algunas muestras podrían corresponder a individuos infectados con cepas no clonales producto de la combinación de linajes principales8. En este estudio, de las 96 muestras analizadas, 20 fueron positivas para RH, pero negativas para NTE, mientras que 2 fueron positivas para NTE y negativas para RH, indicando la posible circulación de linajes tipo I y tipo II en el territorio nacional.
Estos hallazgos destacan la importancia de considerar la variabilidad antigénica de T. gondii en la interpretación de resultados serológicos. La diferencia en la reactividad entre las cepas RH y NTE, así como frente a la proteína p30 recombinante, evidencia que la selección de antígenos influye en la sensibilidad y especificidad del ELISA. En el contexto nacional, estos datos preliminares proporcionan información valiosa para guiar investigaciones futuras y optimizar el diagnóstico de toxoplasmosis en animales y humanos, adaptando estrategias que ya se aplican internacionalmente a la realidad local.
