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INTRODUCCIÓN
El desarrollo de resistencia a los antimicrobianos (RAM) en las bacterias es actualmente uno de los problemas de salud pública más importantes del mundo. El uso indiscriminado de agentes antimicrobianos en humanos y animales condujo a reducir el efecto potencial de estas drogas para el tratamiento eficaz de las infecciones en el hombre1.
En el año 2010, bajo el concepto “Una Salud” la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), la Organización Mundial de la Sanidad Animal (OIE) y expertos internacionales de salud pública, sanidad animal y medio ambiente declararon que la resistencia de bacterias a los antimicrobianos, junto con la rabia y la influenza de origen animal, son las tres principales amenazas mundiales emergentes y reconocieron una responsabilidad conjunta de hacer frente a las zoonosis y a otras enfermedades de alto impacto socioeconómico, con el objetivo a largo plazo y con colaboración internacional, de coordinar actividades a nivel mundial para superar los riesgos para la salud en la interfaz entre humanos, animales y ecosistemas2.
En mayo del 2015, se aprobó el Plan de acción mundial para la lucha contra la RAM en la 68ª Asamblea Mundial de la Salud; con el compromiso de los países miembros a trabajar en los planes nacionales3.
En Paraguay, el Plan Nacional de Resistencia a los Antimicrobianos 2019-2023 fue aprobado en fecha 29 de abril del 2019 (Resolución S.G 163/2019 del Poder Ejecutivo)4, quedando encomendada la implementación y difusión al Comité Técnico multisectorial, bajo la coordinación de la Dirección General de Vigilancia de la Salud.
El uso y abuso de los antimicrobianos no sólo está limitado al ámbito humano; en medicina veterinaria también lo hacen con diferentes objetivos: terapéutico, profiláctico, metafiláctico y como promotor de crecimiento5. Los dos primeros se comparten con la medicina humana, como prevención y tratamiento de una enfermedad infecciosa; en cuanto al tercero, es cuando se suministra antimicrobianos a un lote de animales por que han tenido contacto con el agente infeccioso y así evitar un brote; y el último, cuando se administra en dosis subterapéuticas, con el objetivo de mejorar la calidad del producto final y el control de bacterias zoonóticas6. Este uso indiscriminado en muchas investigaciones se asocia a la emergencia de la resistencia en medicina veterinaria7.
Estudios llevados a cabo por investigadores de la región demostraron la existencia de RAM en microrganismos que forman parte de la microbiota intestinal de bovinos, como Escherichia coli (E. coli), tanto de ganados bovinos para leche como para carne. Sin embargo, el nivel de resistencia es diferente entre ambos grupos. Aislamientos provenientes de ganados bovinos para leche presentan un perfil de RAM mayor que el del los de ganados para carne; pudiendo ello ser atribuido a diversas causas tales como, el tipo de alimentación (intensiva), confinamiento y la utilizacion de antimicrobianos en profilaxis y tratamiento de patologías infecciosas, como la mastitis8,9.
En nuestro pais, los conocimientos sobre los perfiles de RAM en el sector veterinario son escasos, debido a la falta de difusión de los hallazgos.
Este trabajo de investigación llevado a cabo en aislamientos de E. coli provenientes de muestras cecales de ganado bovino para carne, se realizó con el objetivo de estudiar la presencia y prevalencia de resistencia a diferentes antimicrobianos de importancia en la salud pública.
MATERIALES Y MÉTODOS
Estudio prospectivo, observacional, de corte transversal con muestreo no probabilístico por conveniencia.
Las instituciones que llevaron a cabo el trabajo de investigación fueron: Laboratorio Central de Salud Pública (LCSP) y Servicio Nacional de Calidad y Salud Animal (SENACSA), en el marco del objetivo 2 para la implementación del Plan Nacional de Acción contra la Resistencia a los Antimicrobianos (RAM). El mismo fue presentado como propuesta de investigación por el Comité Técnico Nacional de RAM para su ejecución con la cooperación de Unión Europea (UE)-OPS/OMS-OIE-FAO, que brinda apoyo a varios países de la región bajo el lema “Trabajando juntos para combatir la resistencia a los antimicrobianos”10.
Población de estudio y muestreo
Fueron sujetos a estudio los bovinos faenados en 3 establecimientos frigoríficos que se encuentran ubicados en la zona de influencia del Arroyo Mburicao, sitos entre la Avenida Artigas y la desembocadura del Río Paraguay, provenientes de establecimientos de todo el país, tanto de la Región Oriental como de la Región Occidental.
Se les realizó la toma de muestra a los animales que llegaron vivos a la planta frigorífica y habían pasado la inspección ante-mortem, elegidos al azar, en el marco temporal comprendido entre setiembre y noviembre del año 2021.
La toma de muestras cecales de los bovinos de carne seleccionados fue realizada por inspectores veterinarios de la Dirección General de Laboratorios (DIGELAB) y Dirección General de Calidad e Inocuidad de Productos de Origen Animal (DIGECIPOA) de SENACSA, según el manual de procedimientos para la toma de muestra del Sistema Integrado Nacional de Monitoreo de la Resistencia Antimicrobiana en la Cadena Agroalimentaria (SINMRA-Paraguay)11.
Transporte de las muestras cecales al laboratorio
Una vez obtenidas las muestras cecales, fueron transportadas de manera refrigerada (2-8°C) al Dpto. de Bacteriología y Micología del Laboratorio Central de Salud Pública para su procesamiento, acompañadas de una ficha de recolección de datos en la que fueron registrados todos los datos individuales de cada animal.
Cultivo de las muestras cecales en medios selectivos
Las muestras fueron procesadas realizando cultivo en el medio cromogénico selectivo para aislamiento E. coli en base a triptona bilis x-glucorónido (TBX) de la marca OXOID® de la línea Thermo (UK), el cual fue suplementado con distintos antibióticos en concentraciones conocidas, a fin de seleccionar las cepas de E. coli resistentes a los antimicrobianos a estudiar, cuyas concentraciones finales en el agar fueron: 4 ug/mL cefotaxima (CTX), 1 ug/mL meropenem (MEM), 0.25 ug/mL ciprofloxacina (CIP) y 3 ug/mL colistina (COL). Las soluciones de los distintos antibióticos fueron preparadas en concentraciones 20 veces superior a las concentraciones finales en el agar12,13.
Las colonias desarrolladas fueron identificadas con pruebas bioquímicas convencionales, la evaluación de la portación de genes de resistencia a los antimicrobianos estudiados se hizo por reacción en cadena de la polimerasa de punto final, y el perfil de susceptibilidad por el método de difusión de Kirby-Bauer y microdilución en caldo.
Tamizaje fenotípico de resistencia a los antimicrobianos
El desarrollo de colonias de color azul verdoso en los medios cromogénicos suplementados fue utilizado como tamizaje fenotípico de resistencia de E. coli resistente a los distintos antimicrobianos.
Estudios fenotípicos a los aislamientos de E. coli.
Las identificaciones de los aislamientos fueron realizadas por pruebas bioquímicas convencionales y la determinación del perfil de susceptibilidad por las metodologías de Kirby Bauer y microdilución en caldo.
Para evaluar la portación de resistencia por la presencia de enzimas, fueron ensayadas las pruebas de sinergia con doble disco (DDST), utilizando discos de antibióticos y los diferentes inhibidores, ubicados estratégicamente; a fin de detectar los efectos sinérgicos entre ellos14-18.
La evaluación del perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos fue determinada por el método de difusión de Kirby Bauer siguiendo pautas del Clinical Laboratory Standards Institute19, a fin de evaluar el fenotipo de resistencia de los aislamientos seleccionados. Los antimicrobianos ensayados fueron: cefotaxima 30 ug (CTX), amoxicilina/ácido clavulánico 30 ug (AMC), ceftazidima 30 ug (CAZ), ácido nalidíxico 30 ug (NAL), ciprofloxacina 5 ug (CIP), ertapenem 10 ug (ERT), imipenem 10 ug (IMP), trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75 ug (SXT), gentamicina 10 ug (GEN), amicacina 30 ug (AMK). Además, fue evaluada la colistina (COL) por el método de microdilución en caldo y la interpretación de los resultados fue realizada utilizando los criterios de EUCAST 202120.
Estudios genotípicos
Realizado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de punto final, utilizando cebadores específicos, a fin de evaluar los genotipos de mecanismos plasmídicos de resistencia a los antimicrobianos en estudio, con previa evaluación fenotípica21. Los genes evaluados fueron: bla CTX-M, bla PER-2 , bla KPC , bla NDM, Qnr A, Qnr B, Qnr S, aac-6´-Ib-cr y mcr.
Para la obtención del ADN, se utilizó el método de lisis bacteriana por ebullición durante 10 minutos de una suspensión bacteriana de aproximadamente 0,5 Mac Farland en 300 uL de agua libre de RNAsa y centrifugada posteriormente a 10.000 rpm por 10 minutos Las reacciones de amplificación de los genes se realizaron en un termociclador TC-PRO (BOECO Germany) y los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% en tampón TAE buffer (PanReac AppliChem - ITW Reagents). Las imágenes de los patrones electroforéticos fueron obtenidas con el equipo fotodocumentador Gel DocTM EZ Imager (BIO-RAD) y analizadas con el programa Image Lab 6.0 (BIO-RAD).
Control de calidad
Las cepas utilizadas para el control de calidad fueron Escherichia coli ATCC® 25922™, Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603™, BAA-1705 y OPS 229-Encuesta N° 23-Programa Latinoamericano de Control de Calidad en Bacteriología y Resistencia a los Antimicrobianos22.
Tamaño de muestra
Teniendo en cuenta hallazgos publicados en el país y en la región, y la población de ganado bovino en Paraguay registrada en SENACSA, se llevaron a cabo los cálculos del tamaño de muestra, esperando un nivel de confianza del 95%.
Para la evaluación de resistencia a los antimicrobianos en E. coli aislados de muestras cecales de bovinos de carne para producción cárnica, el cálculo se realizó en base a estudios publicados por San Martin B et al.8 con el 11% de proporción esperada, nivel de confianza del 95%, efecto de diseño de 1 y precisión del 5%, dando como resultado de tamaño muestral de 151, lo cual fue considerado como mínimo para este trabajo, accediendo a la toma de 181 muestras.
RESULTADOS
De las 181 muestras cecales de bovinos para carne procedentes de 23 establecimientos diferentes, 86 correspondieron a la Región Oriental y 95 a la Región Occidental; todas de ganado con el tipo de alimentación extensiva y sin antecedentes de tratamiento antimicrobiano previo en los últimos 2 meses; de ellos, 97 fueron machos y 84 hembras.
El promedio de edad de los bovinos machos fue de 29,8 meses (20 a 96 meses) y el peso promedio fue de 272,3 kilos (101,4 a 565,2 kilos). En cuanto a las hembras, el promedio de edad fue 30,9 meses (20 a 96 meses) y el peso promedio fue de 297,3 kilos (163 a 532 kilos).
Ninguna de las muestras estudiadas tuvo desarrollo de colonias en los medios cromogénicos suplementados con CTX, COL y MEM; obteniéndose desarrollo de E. coli sólo en los medios suplementados con CIP, de un total de 15 muestras (8,3%), en los que se confirmaron la portación de uno o más genes de resistencia plasmídica a las quinolonas.
De las 15 muestras positivas, 11 fueron procedentes de la Región Occidental (6 machos y 5 hembras) y 4 de la Región Oriental (solo hembras). Las hembras, con edad entre 24 a 60 meses y peso entre 168,2 y 532 kilos; y los machos 24 a 60 meses y 183 a 501,2 kilos. Tabla 1.
Tabla 1. Genes de resistencia plasmídica confirmada en aislamientos de E. coli de muestras cecales de ganado bovino para carne. Año 2021. N: 181.
| IDENTIFICACIÓN | REGIÓN | EDAD (meses) | PESO (kilos) | SEXO | GENES DE RESISTENCIA PLASMÍDICA |
| F38 | OC | 24 | 501,2 | M | Qnr S; aac-6´-Ib-cr |
| F50 | OC | 60 | 183 | M | Qnr S; aac-6´-Ib-cr |
| F56 | OR | 60 | 444 | H | Qnr S |
| F58 | OR | 36 | 532 | H | Qnr S |
| F59 | OR | 36 | 416 | H | Qnr S |
| F60 | OC | 60 | 168,2 | H | Qnr S |
| F62 | OC | 24 | 176,8 | H | Qnr B |
| F64 | OC | 24 | 223,6 | H | Qnr S |
| F77 | OC | 36 | 178,8 | H | Qnr S |
| F84 | OR | 24 | 330 | H | Qnr S; Qnr B |
| F88 | OC | 24 | 381,2 | H | Qnr B |
| F152 | OC | 24 | 271 | M | Qnr B |
| F153 | OC | 24 | 217 | M | Qnr B |
| F155 | OC | 48 | 237 | M | Qnr B |
| F156 | OC | 24 | 241 | M | Qnr B; Qnr S |
OC: Occidental; OR: Oriental; M: macho; H: hembra.
Fuente: Dpto. Bacteriología y Micología. Laboratorio Central de Salud Pública.
Los genes de resistencia plasmídicos confirmados en los aislamientos resistentes a la CIP fueron: Qnr B, Qnr S y aac-6´-Ib-cr en la Región Occidental; y, Qnr B y Qnr S en la Región Oriental. En ambos casos fueron confirmados aislamientos con portación de más de 1 gen de resistencia plasmídica, detallados en la Tabla 1.
En cuanto al perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos, todos los aislamientos de E. coli con resistencia fenotípica a CIP, fueron susceptibles a las cefalosporinas de 3ra generación (CAZ y CTX), carbapenémicos (ERT, IMP) testados, así como a COL. Sin embargo, el 100% de los mismos resultaron resistentes a TET y NAL y el 53% a SXT. Los halos de inhibición de CIP arrojaron resultados cuyas interpretaciones fueron resistentes (2/15) y sensibilidad intermedia (13/15). Los resultados de las pruebas de susceptibilidad están resumidos en la Tabla 2.
Tabla 2. Perfil de susceptibilidad de aislamientos de E. coli, portadores de resistencia plasmídica a quinolonas, de muestras cecales de ganado bovino par carne. Año 2021. N: 181.
| KIRBY BAUER (halo de inhibición) | MICRODILUCIÓN EN CALDO CIM (ug/mL) | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| IDENTIFICACIÓN | NAL | CIP | TET | SXT | CAZ | CTX | AMC | GEN | AMK | ERT | IMP | COL |
| F38 | 11 | 21 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 16 | 30 | 28 | < 2 |
| F50 | 11 | 21 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 16 | 30 | 28 | < 2 |
| F56 | 12 | 25 | 6 | 30 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F58 | 12 | 24 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F59 | 12 | 25 | 6 | 30 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F60 | 12 | 25 | 6 | 30 | 26 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F62 | 12 | 24 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F64 | 12 | 25 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F77 | 12 | 24 | 6 | 30 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F84 | 13 | 24 | 6 | 30 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F88 | 12 | 25 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F152 | 12 | 25 | 6 | 6 | 27 | 32 | 23 | 20 | 20 | 30 | 28 | < 2 |
| F153 | 13 | 24 | 6 | 30 | 26 | 30 | 20 | 20 | 20 | 32 | 31 | < 2 |
| F155 | 12 | 25 | 6 | 6 | 27 | 30 | 20 | 20 | 22 | 30 | 28 | < 2 |
| F156 | 12 | 24 | 6 | 30 | 27 | 30 | 22 | 19 | 20 | 32 | 29 | < 2 |
NAL: ácido nalidíxico; CIP: ciprofloxacina; TET: tetraciclina; SXT: trimetoprim/sulfametoxazol; CAZ: ceftazidima; CTX: cefotaxima; AMC: amoxicilina/ácido clavulánico; GEN: gentamicina; AMK: amicacina; ERT: ertapenem; IMP: imipenem; COL: colistina; CIM: Concentración Inhibitoria Mínima.
Fuente: Dpto. Bacteriología y Micología. Laboratorio Central de Salud Pública.
DISCUSIÓN
El principal hallazgo de este trabajo de investigación, llevado a cabo en muestras cecales de ganado bovino para carne, con procedencia de ambas regiones del país, faenados en 3 frigoríficos de la zona de influencia del arroyo Mburicao; fue la resistencia antimicrobiana a las fluoroquinolonas en un 8,3%; utilizando E. coli como bacteria indicadora, como así también la confirmación del mecanismo plasmídico de resistencia por la portación de los genes Qnr S, Qnr B y aac-6´-Ib-cr.
San Martin et al., en un estudio llevado a cabo en Chile en el 2005 en aislados de E. coli de ganado bovino para carne, encontraron una resistencia antimicrobiana del 11 %, cercano a nuestro hallazgo en este trabajo.8
Por otro lado, no encontramos aislamientos de E. coli con resistencia a los otros antimicrobianos evaluados (cefotaxima, colistina, meropenem), resultado de gran relevancia debido a la creciente preocupación generada por la evolución de la resistencia antimicrobiana en las bacterias que habitan los diversos nichos ecológicos.
Un hallazgo preocupante es la resistencia acompañante encontrada en los aislamientos resistentes a las fluoroquinolonas; ya que todos ellos fueron resistentes a TET y el 53% resistentes a SXT. Estos datos generados deberían ser considerados para la elaboración de reglamentaciones nacionales para la comercialización y uso de estos antimicrobianos en medicina veterinaria y como agentes promotores de crecimiento. En nuestro país, solo está regulado el uso de la colistina. A partir del 2019, SENACSA, por Resolución N.º 1150/2019 prohibió la elaboración, distribución, importación y tenencia de productos veterinarios que contengan en su formulación el principio activo de la colistina y sus sales, por ser considerado un antimicrobiano de última línea en el tratamiento de las enfermedades infecciosas graves en humanos y su uso descontrolado estaría promoviendo la selección y propagación de resistencia bacteriana23.
La contención de la RAM requiere la toma de medidas con un enfoque multisectorial. La creación y funcionamiento de una Red de vigilancia de la RAM en el sector veterinario en el país es necesaria y urgente, a fin de generar conocimientos epidemiológicos de los gérmenes zoonóticos o comensales, los cuales podrán ser utilizados para la elaboración de guías terapéuticas locales para el uso prudente de antimicrobianos en ese sector, como así también poder determinar y monitorear el perfil de resistencia en estas bacterias.
