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INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis es una enfermedad que representa un serio problema de salud pública, se distribuye en zonas tropicales y sub tropicales de África, Asia, América del Sur y la zona del Mediterráneo1, con una estimación de 2 millones de casos por año y el tratamiento es limitado por la toxicidad, baja eficacia y dificultad de acceso a los medicamentos2. Por otro lado, la enfermedad de Chagas es una patología cuya quimioterapia actual se basa casi exclusivamente en el uso de benznidazol, pero, nuevas drogas con menos efecto secundario y con mayor actividad tripanocida son necesarias3 debido a que el tratamiento actual posee severos efectos colaterales tóxicos4,5. Al igual que en la leishmaniasis, numerosos grupos de investigación están abocados a la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas eficaces y seguras. Es así que, en el caso de las especies de plantas paraguayas con propiedades medicinales prometedoras destaca la rutácea Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium Engl. que entre otros compuestos aislados tiene una familia de alcaloides de tipo beta-carbolina llamados cantinonas, siendo las más abundantes la cantin-6-ona y 5-metoxicantin-6-ona. Estos alcaloides fueron aislados a partir de la corteza del tronco y de las hojas de este árbol y se destacan por presentar interesante actividad antiparasitaria in vivo contra las formas amastigotes y tripomastigotes de T. cruzi6 y leishmanicida7. Ferreira et al.8 evaluaron los efectos antiparasitarios del cantin-6-ona, el 5-metoxicantin-6-ona, el N-oxido de cantin-6-ona (5 mg/kg/día durante 2 semanas) y los alcaloides totales de la corteza del tronco de Z. chiloperone (50 mg / kg / día durante dos semanas) en comparación con benznidazol (50 mg / kg / día durante 2 semanas) en ratones en fase aguda y crónica de la infección con T. cruzi. En este estudio, la parasitemia se redujo significativamente después del tratamiento por vía oral con cantin-6-ona y el extracto de alcaloides totales, en los casos agudos y se observaron altos niveles de eliminación parasitológica. En la fase crónica de la enfermedad, tanto cantin-6-ona como el extracto conteniendo los alcaloides totales, indujeron un 80-100% de supervivencia en los animales, en comparación con el grupo control no tratado. Estos resultados indican que la cantin-6-ona exhibió actividad tripanocida en un modelo de infección crónica; mientras que el 5-metoxicantin-6-ona si bien presentó una acción limitada contra T. cruzi, mostró una reducción rápida de la parasitemia y parásitos circulantes. En relación a la leishmaniasis, Ferreira et al7 mostraron que el cantin-6-ona presentó una baja toxicidad y una interesante efectividad cuando fue administrada de forma interlesional y sugirieron otros estudios para determinar su uso en el tratamiento de la leishmaniasis cutánea.
Los grupos de trabajo de la Unión Europea (EU), la Organización Económica de Cooperación y Desarrollo (OECD) y también la Conferencia Internacional de Armonización de Requerimientos Técnicos para el Registro de Productos farmacéuticos de Uso Humano (ICH) han definido el uso de baterías de ensayos de genotoxicidad, tanto in vitro como in vivo9 necesarios para la evaluación de moléculas con posible acción terapéutica. Así, el ensayo de micronúcleos en células de médula ósea de ratas o ratones es un ensayo de fácil acceso10. Los micronúcleos en eritrocitos jóvenes surgen primariamente de fragmentos cromosómicos que no son incorporados en las células hijas en el momento de la división celular de células eritropoyéticas mientras que los cambios en la incidencia de EPCMNs se consideran que reflejan daños cromosómicos11,12. Este ensayo es válido tanto para realizar un estudio de los efectos genotóxicos (clastogénicos o aneugénicos) de algunas substancias como para estudiar los posibles efectos protectores de otras substancias13. La aplicación de este ensayo está en consonancia con la estrategia adoptada internacionalmente en la evaluación del potencial aneugénico o clastogénico de potenciales moléculas de actividad farmacológica14. Dado que la presencia de micronúcleos (MN) se traduce en el ámbito celular como pérdida de ADN, esta técnica es entonces una alternativa muy eficaz para el monitoreo de genotóxicos de manera fácil, sencilla, rápida y con resultados contundentes15. La prueba permite detectar tanto agentes clastogénicos (que rompen cromosomas), como aneuploidogénicos (que pueden afectar el huso mitótico), pudiéndose diferenciar unos de otros por el tamaño de los MN y presencia de centrómero16.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial genotóxico y citotóxico de las moléculas cantin-6-ona y 5-metoxicantin-6-ona en células de médula ósea de ratones tratados por vía oral en un tratamiento sub agudo en dos ensayos independientes utilizando las pruebas de modificación de la frecuencia de micronúcleos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Materiales: Suero Bovino Fetal (PAA), Ciclofosfamida (SIGMA), Metanol.
Extractos: El cantin-6-ona y el 5-metoxicantin-6-ona fueron extraídos, liofilizados y mantenidos a -20°C hasta el momento del uso. Cada liofilizado se diluyó en 2.1% de dimetilsufóxido (DMSO) y agua destilada.
Animales: Se utilizaron ratones Swiss albinos, hembras (cantin-6-ona) y machos (5-metoxicantin-6-ona), de 6-8 semanas de vida, peso corporal 28-30 gramos, mantenidos en un ambiente con temperatura controlada con agua y comida ad libitum, con 12 h de luz y 12 h a oscuras, en el bioterio del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS). Se realizaron dos ensayos por separado, cada ensayo tuvo sus controles, negativo y positivo. Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de 5 animales (ensayo 1) o 6 animales (ensayo 2).
Tratamientos: En cada ensayo se emplearon tres grupos de tratamiento. Ensayo 1: GRUPO I: control negativo, tratado con 200µl de agua destilada con DMSO al 2.1%, GRUPO II: tratado con 20 mg/Kg peso animal, del compuesto cantin-6-ona y GRUPO III: control positivo, tratado con 50 mg/Kg. de ciclofosfamida. Ensayo 2: GRUPO I: control negativo, tratado con 200µl de agua destilada con DMSO al 2.1%, GRUPO II: tratado con 20 mg/Kg peso animal de 5-metoxicantin-6-ona, GRUPO III: control positivo, tratado con 50 mg/Kg de ciclofosfamida. Para las concentraciones utilizadas en cada grupo, se tomaron como referencia las dosis empleadas en los ensayos in vivo de actividad antiparasitaria de productos naturales realizados previamente por nuestro grupo de trabajo. La vía utilizada en la administración del control negativo y de los compuestos en los grupos I y II de cada ensayo fue oral (v.o.) durante 4 días y en el grupo III la vía fue intraperitoneal (i. p.), en única dosis, 24 horas antes del sacrificio.
Ensayo de micronúcleo: Los animales de los ensayos 1 y 2 se sacrificaron por ruptura cervical a las 48 hs de finalizado el tratamiento, estando este tiempo de muestreo basado en la cinética de maduración de los eritrocitos en ratones. El procedimiento empleado para la obtención de las preparaciones de la medula ósea fue realizado de acuerdo a la metodología propuesta por Schmid17. Se tiñeron las muestras con colorante Giemsa al 5%, diluido en agua destilada estabilizada con tampón. Se analizaron las muestras en microscopio óptico de inmersión y se contaron 1000 eritrocitos policromáticos (EPCs) incluyendo los que presentaron micronúcleos (EPCMNs), por animal tratado. La proporción de EPCMNs fue realizada para cada grupo y los grupos de tratamiento de los compuestos y ciclofosfamida (CP) fueron comparados con el grupo control negativo. Para el análisis de citotoxicidad se utilizaron las mismas muestras del ensayo de micronúcleo, donde se analizaron 200 células por animal tratado y se observó la proporción de eritrocitos policromáticos (EPC) versus la proporción de eritrocitos normocromáticos (ENC).
Análisis estadístico: A partir de los valores individuales de los parámetros evaluados se calcularon los valores medios y sus desviaciones estándar, para cada uno de los grupos experimentales. Los datos fueron procesados mediante el software de análisis estadístico EpiInfoTM versión 3.5.1. y el ensayo estadístico ANOVA con un nivel de significancia de p<0,05.
Asuntos éticos: El protocolo No. 1305-2005-14 de este estudio fue aprobado por el Comité Ético y Científico del IICS. Se siguieron las recomendaciones de la Guía de Principios Internacionales para Investigaciones Biomédicas que envuelven animales, elaborados por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas18. Se utilizó la cantidad mínima posible de animales y se tomaron todas las precauciones para evitarles sufrimientos innecesarios.
RESULTADOS
Análisis de la frecuencia de micronúcleos:
Los criterios de genotoxicidad tomados fueron los recomendados por OECD19 (1993) y los de Hayashi et al.15, comparando las frecuencias de EPCMNs en una o más dosis del grupo de tratamiento con respecto al control negativo. En la Tabla 1 se muestran los resultados del análisis de la inducción de micronúcleos en médula ósea de ratones con el compuesto cantin-6-ona. Se evaluaron 5000 células por cada grupo de tratamiento, el porcentaje de EPCMNs en el grupo control negativo fue de 0.2% y el porcentaje de EPCMNs en el grupo control positivo, tratados con una dosis única de ciclofosfamida, fue de 3.5%. También se muestra la relación EPC/ENC, analizada para evaluar el potencial citotóxico del tratamiento. Si existe una diferencia significativa en la comparación de la relación de los tratamientos con el control negativo es indicativa de toxicidad.
Tabla 1: Frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados, media y desvío estándar (SD), en médula ósea de ratones hembras tratadas con cantin-6-ona.
| Grupo experimental | Total EPC | Total EPCMN | Número de EPCMN (%) | EPC Media ± SD | Ratio EPC/ENC |
|---|---|---|---|---|---|
| CTL- | 5000 | 12 | 0.24 | 2.4±1.1 | 1,10 |
| CP | 5000 | 179 | 3.5 | 25.8±5.1 | 1,15 |
| Canthin-6-ona | 5000 | 13 | 0.26 | 2.6±1.1 | 1,10 |
EPC: Eritrocito Policromático; EPCMNs: Eritrocitos Policromático Micronucleado; ENC: eritrocito Normocromático; CP: ciclofosfamida. Datos procesados por el software de análisis estadístico EpiinfoTM versión 3.5.1.Ensayo estadístico ANOVA (p<0,05).
Por otro lado, en la Tabla 2 se observan los valores de MN en los grupos de ratones que han sido tratados con el compuesto 5-metoxicantin-6-ona en células de médula ósea de ratones, se evaluaron 6000 células por grupo de tratamiento, donde el porcentaje del EPCMNs en el grupo de control negativo fue de 0,5 % y el porcentaje de EPCMNs en el grupo control positivo, tratados también con dosis única de ciclofosfamida fue de 3.4% mientras que en el grupo 5-metoxicantin-6-ona fue de 0.5%. Se muestra la relación EPC/ENC de los 3 grupos analizados.
Tabla 2: Frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados, media y desvío estándar (SD), en médula ósea de ratones machos tratados con 5-metoxicantin-6-ona.
| Grupo experimental | Total EPC | Total EPCMN | Número de EPCMN (%) | EPC Media ± SD | Ratio EPC/ENC |
|---|---|---|---|---|---|
| CTL- | 5000 | 25 | 0.5 | 5±2.2 | 1,19 |
| CP | 5000 | 174 | 3.4 | 34.8±6.8 | 1,08 |
| 5-metoxicantin-6-ona | 5000 | 29 | 0.5 | 5.8±3.3 | 1,14 |
EPC: Eritrocito Policromático; EPCMNs: Eritrocitos Policromático Micronucleado; ENC: eritrocito Normocromático; CP: ciclofosfamida. Datos procesados por el software de análisis estadístico EpiinfoTM versión 3.5.1.Ensayo estadístico ANOVA (p<0,05)
DISCUSIÓN
En la búsqueda de nuevos principios activos para el tratamiento de enfermedades endémicas o regionales es necesario evaluar los posibles efectos secundarios de los mismos, para evitar o minimizar las secuelas del tratamiento. Las drogas utilizadas actualmente en el tratamiento de la leishmaniasis presentan efectos secundarios tóxicos o genotóxicos20-23 así como las utilizadas en el tratamiento de la enfermedad de Chagas24-25, lo que hace necesaria la búsqueda de nuevas alternativas de tratamiento de estas enfermedades. De acuerdo a la OECD se deben aplicar varios ensayos básicos para determinar el potencial mutagénico, clastogénico o aneugénico, tanto in vitro como in vivo, en el desarrollo de nuevos productos químicos con potencial farmacológico10. La actividad de los principios activos extraídos de la planta Zanthoxylum chiloperone, cantin-6-one y el 5-metoxicantin-6-ona ya fue analizada in vitro e in vivo por nuestro equipo de trabajo en una fase inicial, donde se ha visto que presentaron una actividad antiparasitaria importante6,8,26. La concentración utilizada en este estudio representa el promedio de la concentración utilizada en los ensayos de evaluación de la actividad antiparasitaria de los productos in vivo27. Las dosis de tratamiento utilizadas en ambos ensayos fueron seleccionadas con la finalidad de conocer los límites de concentración de uso del producto. Los resultados indican que los compuestos evaluados no inducen un aumento de daño genotóxico en células de médula ósea de ratones cuando son expuestas al mismo en un tratamiento agudo de 96 hs. Resulta imprescindible para estos ensayos la utilización de un control negativo (vehículo o solvente de los compuestos evaluados) por que las respuestas genotóxicas y toxicas de dichos compuestos se evidencian en la comparación con los valores de sus respectivos controles y un control positivo que valide el ensayo; los porcentajes de EPCMNs en el grupo control negativo fueron de 0.2% y 0.5%, valores que se encuentran en los rangos descritos en la literatura28-30 y que son valores dentro del rango normal. Con respecto al grupo control positivo, los datos obtenidos en este estudio concuerdan con los datos reportados en la literatura, ya que el análisis estadístico mostró que la frecuencia de micronúcleos en células de médula ósea en los animales tratados con ciclofosfamida fue significativa, cuando fue comparada con el grupo control negativo31. En cuanto al efecto citotóxico de ambas moléculas hemos observado que tanto el cantin-6-ona y el y el 5-metoxicantin-6-ona no han presentado ninguna actividad citotóxica en células de médula ósea, por lo que se deduce que no presentan actividad citotóxica ni genotóxica. La concordancia de los resultados obtenidos con la ciclofosfamida en este estudio con los encontrados en la literatura31 validan los resultados obtenidos en la evaluación de los principios activos cantin-6-ona y 5-metoxicantin-6-ona.
Los resultados obtenidos en la evaluación de estos compuestos derivados de la planta de Zanthoxylum contribuyen al conocimiento de sus posibles efectos secundarios e indican que podrían ser candidatos a ser incorporados en la medicina humana como antifúngicos, antichagásicos o leishmanicidas en el futuro. Resulta indudable la importancia de estos resultados en la búsqueda de alternativas más seguras para el tratamiento de la tripanosomiasis y la leishmaniasis. Sin embargo, otros análisis deben ser aplicados para tener mayor seguridad de que estas moléculas no presentan efectos adversos, como ser, el ensayo de genotoxicidad en células humanas tratadas in vitro32 o ensayos in vivo en modelos murinos con mayores tiempos de exposición.
