INTRODUCCIÓN

Las infecciones del sistema nervioso central causadas por virus aunque no son frecuentes tienen importancia debido a su gravedad, constituyendo una emergencia pediátrica ya que su rápido diagnóstico y manejo son decisivos en el pronóstico y seguimiento de la evolución. Entre ellas, la meningitis y encefalitis son cuadros agudos más frecuentes.

Los virus son agentes de reconocida prevalencia en el líquido cefalorraquídeo (LCR) claro o aséptico, compatible con meningitis (inflamación meníngea del espacio subaracnoideo) asociándose en 90% a enterovirus humanos (EV), tanto en niños como en adultos, sin predominio de género¹.

El género Enterovirus perteneciente a la familia de los Picornavirus son virus ARN de menor tamaño, con más de 100 serotipos, ubicuos y de diseminación fecal - oral, siendo el tracto alimentario, la principal puerta de entrada por contacto directo o indirecto con manos o aguas contaminadas. El periodo de incubación es de 7 a 14 días y las personas con infección subclínica pueden eliminarlos en las heces por varias semanas y en faringe por 1 a 2 semanas². Son responsables de brotes o casos esporádicos, que varían según la época del año, la localización geográfica, edad y el nivel socio-económico. En países templados se observan frecuentemente en las estaciones cálidas pero en los tropicales durante todo el año, siendo los Coxsackie B5 y los Echovirus 4,6,9,11 y 30, los que producen las meningitis con frecuencia y con importante morbilidad³. Entre ellos podemos mencionar a Estados Unidos de Norteamérica, donde probablemente causen alrededor de las tres cuartas partes de todos los casos de meningitis viral notificados. En México constituyen causa importante de meningitis viral y son responsables del 80 -90% de las Encefalitis, en lactantes y menores de 5 años, identificándose los Coxsackie B5, B2, B4, B3, B1 y los Echovirus 11, 9, 30, 4, 6, 3, 7, 5 y 21⁵. En Japón, se reportó el Echovirus tipo 9 en 1990 y en Alemania, un brote en 21 niños por Echovirus tipo 30, con una tasa de ataque de 24%, en 1997. En países de nuestra Región, la Argentina reporto casos desde el 1983 asociados a los Coxsackie B1, B3 y B5 así como a los Echovirus 11, 21 y 25⁸.

Más del 90% de las afecciones por los enterovirus pueden ser asintomáticas y los cuadros varían desde el sindrome pie-mano-boca hasta pericarditis y meningitis. Otro aspecto importante de la etiología de los enterovirus son las infecciones neonatales, que se adquieren de la madre o por transmisión nosocomial. La frecuencia con que se aísla un determinado serotipo varía marcadamente, ya que algunos se detectan por varios años produciendo epidemias y luego desaparecen en la siguiente estación.

El diagnóstico de la meningitis viral se basa en la presentación clínica, que generalmente es aguda con signos meníngeos, imágenes, el estudio cito químico del líquido cefalorraquídeo, junto a la identificación del agente etiológico. La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), actualmente se constituye en el Gold Standard, reemplazando así al aislamiento viral y serología debido su rapidez, sensibilidad (100%) y especificidad del 95-100%⁴. La más utilizada es la RT-PCR genérica que detecta todos los serotipos de Enterovirus al amplificar la región 5 NC, más conservada del genoma⁵. La PCR permite diferenciarlas del Virus Herpes Simple, posibilitando el manejo clínico con tratamiento de soporte general, suspendiendo el antiviral (Aciclovir) instaurado, ya que el cuadro es auto limitado, se resuelve en cinco a siete días, disminuyendo los días de internación así como el costo de atención⁶.

En nuestro país los primeros datos disponibles sobre la participación de los Enterovirus en pacientes hospitalizados por serología (IgG e IgM) fueron reportados por Portillo et al. en el 2004⁷. El objetivo de este estudio fue identificar al EV por PCR en el LCR de pacientes con sospecha clínica de meningitis asépticas, internados en diferentes servicios públicos y privados, de Asunción y Departamento Central de noviembre de 2007 a noviembre de 2014.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio descriptivo de corte transversal realizado desde noviembre del 2007 a noviembre de 2014 e incluyó las muestras remitidas al laboratorio de líquidos cefalorraquídeos de pacientes de todas las edades, internados en diferentes servicios públicos y privados del país bajo la sospecha clínica de meningitis por EV por manifestar signos meníngeos y un estudio citoquímico aséptico o a liquido claro.

La extracción de material genético se realizó con el mini kit ARN de Qiagen® utilizando 200 µl de muestra, seguido de una RT con 5 µl del ARN obtenido mediante el Kit MMLV y RNasout de Invitrogen®, llevándolos en el termociclador Mastercycler Personal Eppendorf® a 37°C por 45 min y posteriormente a 94°C por 10 minutos.

En la PCR se realizó la amplificación de la región 5 no codificante pero muy conservada para los EV de acuerdo al protocolo modificado de Giacca (1993)⁷ en 50 µl de volumen final con la Taq DNA Polimerasa recombinante de Invitrogen®, una primera ronda de 45 ciclos de 94°C por 1 min, 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 68°C por 30 segundos y una extensión final de 68°C por 3 min. Del producto obtenido se tomaron 1 ul para la segunda ronda con 35 ciclos de 94°C por 5 minutos, 94°C por 30 segundos, 49°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos y una extensión final de 72°C por 5 min, también a un volumen de 50 ul. Los primers CX3, CX8, CX9 Y CX10 utilizados fueron sintetizados por Invitrogen® y detectaron unos productos de 230 - 120 pb, visualizados en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. El límite de detección fue de 5 copias/ml y los controles positivos que fueron gentilmente proveídos por el Instituto Carlos Malbrán-Argentina. Todo este protocolo se pasó a tiempo real, desde el 2011 utilizando el equipo Rotor gene® y los Iscript Selectc DNA Synthesis Kit y Master mixSso Fast Eva Green Supermix de Bio Rad respectivamente.

RESULTADOS

Se incluyeron muestras de LCR de 203 pacientes internados con sospecha de meningitis por enterovirus por el reporte de un citoquímico (aséptico) compatible con etiología viral, de ellos 124 (61%) fueron de niños con edades comprendidas entre 4 días a 15 años y un 79 (39%) de adultos de 16-81 años. Setenta y siete pacientes (38%) provenían de servicios públicos y 126 (62%) de privados; 115 (57%) fueron del sexo masculino y 88 (43%) del sexo femenino.

En 166 de los LCR se detectó el ARN del Enterovirus con un 82% de positividad, diagnosticándose así meningitis viral afectando principalmente niños (Figura 1), en 90 casos (54 %) niños y a 76 (46%) adultos, siendo el menor de 4 días y el mayor de 81 años.

Figura 1: Enterovirus detectados por grupo etario. Paraguay, 2007-2014. n: 166 

En cuanto a la distribución por sexo, los EV se detectaron en 101 varones (61%) y en 65 mujeres (39%). En su mayoría correspondieron a pacientes internados en diferentes servicios del sector privado 111 (62%) y en el público 56 (38%).

La distribución los casos positivos detectados por año mostró un aumento gradual coincidente con el aumento del número de muestras estudiadas, pero con un 50% como mínimo en cada año, tal como lo muestra en la siguiente Figura 2.

Figura 2: Enterovirus en infecciones del SNC. Paraguay, 207-2014 n: 203 

En cuanto a la distribución estacional, desde el 2011, se observaron más detecciones de casos positivos de octubre a abril, coincidentes con los meses más calurosos en el país, tal como se observa en la Figura 3.

Figura 3: Distribución mensual de los Enterovirus. Paraguay, 2007-2014. n: 166 

DISCUSIÓN

Este primer estudio en el país, con un periodo de 7 años, confirmó un 82% de participación del EV mediante la PCR, en pacientes internados en diferentes servicios, con sospecha de meningitis agudas asépticas de etiología viral. En todos los años el predominio fue de niños (54%), que se observó claramente en el 2013 con 35 casos (65 %) de 54 muestras, aunque este fue el grupo mayoritario analizado, constituyéndose así estos datos en la línea de base nacional.

Los casos de meningoencefalitis afectan en primer lugar a lactantes, lo que se reflejó en nuestra casuística que incluyó a niños desde 4 días de vida, quienes generalmente aún tienen el sistema inmunológico débil, por lo requieren de un diagnóstico oportuno que les garantice la vida. Luego los mayores de 15 años, que constituyen población activa y por último al grupo de los adultos mayores, prácticamente inmunsuprimidos¹⁹, con un paciente de 81 años de edad en este grupo.

Asumiendo que esta etiología viral es difícil de predecir basados únicamente en la presentación clínica y el cito químico del LCR, el 82% por PCR aportó un diagnóstico rápido y confiable¹⁴.

Esta PCR, que utilizó una región muy conservada del genoma entre diversos genotipos de enterovirus¹⁸, posibilitó la identificación rápida de ARN de enterovirus en los casos sospechosos de meningitis aséptica, permitiendo la disminución del tiempo de internación, las complicaciones secundarias (extravasación de la canalización e infecciones nosocomiales) y el uso de antibióticos innecesarios así como el Acyclovir¹⁶.

Se observó un mismo patrón de circulación de EV todos los años pero con más actividad en los meses calurosos, más claramente desde el 2011(81%) coincidente con el incremento de muestras analizadas, lo que indica además la utilidad de esta nueva herramienta diagnóstica, ya que la PCR fue asumida gradualmente por los médicos mejorando así el manejo clínico del paciente.

La participación de los enterovirus en nuestro país fue similar a la registrada en Perú con 83,3% en las meningitis agudas asépticas y en 38,8% en las encefalitis en población pediátrica, también con comportamiento estacional, frecuente en los climas cálidos y en Panamá con un 73%, entre 1998 y 1999¹⁷.

Entre el periodo de 2007 a 2014, los porcentajes de positividad de EV fueron de un 50% o más, confirmando que en nuestro país circulan en todos los años y además se correlacionaron con lo observado en Argentina entre el 2005- 2008 que reportó un 70 %⁸ y que luego en el 2005 - 2010 disminuyó a un 42 %^11,12. En Salvador, Bahía la frecuencia de enterovirus detectados fue de 37,7% en el año 2002¹⁵.

Sin embargo fueron muy elevadas en comparación a la casuística del Brasil, en Rio de Janeiro con un 11%, entre el 2005-2006⁹, en Uruguay con un 10% por el grupo de Burgeño A, en el 2009-2010¹⁰⁾ y la casuística en Colombia, Armenia mostró un 10% de detección de enterovirus por PCR también en niños¹⁸. También un estudio multicéntrico europeo de Vliet en 1993²³, mostró 24,5% de detección por esta metodología comparada con el aislamiento en cultivo que fue solo de 7,5%.

En cuanto a que la mayoría de las muestras (62%) provenían de servicios privados, esto se relacionaría por un lado, con que en el Servicio Público se prioriza la búsqueda de HSV por su gravedad y la necesidad de iniciar el tratamiento con Aciclovir y por otro lado, a los limitados recursos económicos del paciente hospitalario generalmente, puesto que esta metodología aún no está disponible en los hospitales públicos.

Es indiscutible la ventaja que aporta el diagnóstico viral rápido mediante la PCR, en una enfermedad que, aunque benigna, no tiene un tratamiento antiviral específico, tiene un inicio agudo y preocupante. Por tanto tiene sus beneficios no solo para el paciente sino en la comunidad por su impacto en la economía de la salud, al disminuir el consumo de antibióticos como la disminución de la resistencia²⁰.

Si bien el 82% de HEV observado fue elevado y aún falta analizarlo en detalle, sirven para considerar que es una patología importante en nuestro país porque se registran anualmente, causando morbilidad debido a que todas ellas requirieron internación y sería conveniente analizar si hay relación con la calidad y tipo de las aguas a la que accede la población u otra fuente de transmisión a fin de disminuirlas²².

También es importante considerar que la PCR anidada no permitió la diferenciación entre los diferentes enterovirus, por lo que requirió de modificaciones al pasarlas en tiempo real, pero que es imperiosa, la implementación de la Genotipificación a fin de conocer y diferenciar el serotipo circulante en cada temporada^13,21.