INTRODUCCIÓN
La yerba mate es una planta subtropical típica de la Cuenca de la Plata en el Hemisferio Sur Americano. Propia del sur de Paraguay y Brasil y del norte de Argentina, crece en condiciones características del bosque atlántico bajo temperaturas templadas y lluvias por encima de los 1500 mm año-1. Su denominación científica, Ilex paraguariensis, la sitúa dentro de la especie de arbusto mediano, verde, con propiedades medicinales y fitosanitarias (USAID 2006).
En los últimos 5 años, las exportaciones de yerba mate de Paraguay se han duplicado, con cifras de 526 t en el 2009, y de 985,3 t en el 2014 (REDIEX 2014). La demanda en el mercado interno también aumentó en un 15 a 20% en los últimos años, provocando que los precios se mantuvieran alto, e incentivó el incremento de la superficie de producción (REDIEX 2015).
El aumento del área de siembra, la domesticación del cultivo y la reducción del espaciamiento entre las plantas, está favoreciendo el desarrollo de enfermedades y la dispersión de patógenos que ocasionan problemas fitosanitarios en el cultivo (Grigoletti Júnior y Garcia 1996).
La mancha negra de la hoja de yerba mate, también conocida como pinta-preta, es la principal enfermedad fúngica del cultivo. Provoca severos daños, tanto en viveros como en el campo, provocando hasta 30% de pérdidas de las mudas (Grigoletti Júnior et al. 2000).
El agente causal, Cylindrocladium spathulatum sensu G.S
. Ridley (1998) (teleomorfo: Calonectria sphatulata), fue identificado por primera vez a partir de Buxus sp., este patógeno comúnmente ha sido asociado con enfermedades en Eucalyptus sp. (Crous y Wingfield 1994).
El primer reporte de Cylindrocladium spathulatum afectando a las hojas de yerba mate fue hecho por Grigoletti Júnior et al. (1995), en viveros de yerba mate de la zona sur de Brasil.
En septiembre del año 2010 se detectaron síntomas de enfermedades en las hojas y ramas tiernas de la yerba en el nordeste de Argentina en la principal región productora, lo cual ha originado estudios para identificarlos por parte del INTA de Cerro Azul y el departamento de Fitopatología de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE) de Misiones (Rybak et al. 2014).
Recientemente productores de plantas en viveros, localizados próximos a regiones con plantaciones de yerba mate, observaron una alta frecuencia de manchas negras en los cultivos, cuando las condiciones ambientales son de alta humedad, poca ventilación y densidades de plantas muy altas. Teniendo en cuenta la importancia del cultivo para el país y la escasa investigación en el mismo, el diagnóstico correcto y confirmación de la presencia de este patógeno en cultivos de yerba mate es crucial para posteriores estudios de manejo de la enfermedad y así evitar pérdidas a los productores ante posibles epidemias.
El objetivo de este trabajo fue identificar el organismo causal de la mancha negra asociada al cultivo yerba mate en las principales regiones productoras del Paraguay.
MATERIALES Y MÉTODOS
Durante el desarrollo de la brotación de la yerba mate en la zafra de 2014 - 2015, se realizó muestreo dirigido, tomando hojas con síntomas de la mancha negra según lo descrito por Grigoletti Júnior et al. (2000), en los municipios de Carlos Antonio López, San Rafael del Paraná, Mayor Otaño y Tomas Romero Pereira. En el momento de muestreo, se realizaron la descripción de los síntomas observados y siguiendo la escala de Ferretti (1994) se cuantificó la defoliación de las plantas afectadas.
Se extrajeron de las hojas porciones de 0,5 cm de tejido inmediato a los síntomas, y fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 2% durante un minuto, lavada una vez con agua destilada, y posteriormente secadas para poner en placa de Petri en medio papa-dextrosa-agar (PDA), durante un periodo de siete días a temperatura de 28°C (Schaad et al. 2002).
Para la obtención de cepas puras de hongos provenientes de las muestras, se tomó una pequeña muestra del hongo de la placa de Petri y se sembró en medio agua-agar. A las 48 h se observó en el microscopio estereoscópico y con una aguja de punta fina se tomó una hifa en crecimiento y se colocó en medio PDA (French y Teddy 1980).
La identificación se realizó mediante la observación en microscopio óptico y uso de claves descriptivas (Barnett y Hunter 1986, Crous y Wingfield 1994, Crous 2002, Lombard et al. 2010).
Se realizó prueba de patogenicidad con fines reproducir los síntomas observados en el campo, a partir de las cepas de hongos aislados. Se seleccionó al azar un aislado del cual se generaron repiques en placas Petri con PDA como medio de cultivo, se incubaron a temperatura ambiente por 10 días. Se preparó una suspensión de esporas de 1.105 (conidios/mL), posteriormente atomizados sobre plantines de 20 meses. Para ello se raspó la superficie de la colonia y se la puso en un tubo de ensayo al que se agregó agua destilada esterilizada, esta suspensión se filtró y se agitó enérgicamente. Se tomaron alícuotas de la suspensión de los hongos y se procedió al conteo en la cámara de Neubaüer en dos repeticiones, y se ajustó a la concentración requerida. Los plantines fueron dejados a temperatura ambiente en condiciones de alta humedad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los síntomas observados a campo fueron la formación de manchas en forma circular en hojas de yerba mate mayor a 12 meses, en algunos casos aparecen en el centro de las hojas y en otros en el borde. Las manchas comienzan como un punto negro, crecen en forma circular y pueden llegar a alcanzar los 2 cm de diámetro. A medida que crecen las manchas el centro se va necrosando, hasta provocar la caída de las hojas de yerba mate en forma prematura con sentido ascendente, de abajo hacia arriba y de adentro hacia afuera (Figura 1 A y B).
Los focos de infección se presentaron en plantas de yerba mate asociadas con árboles, y que se encuentran con cierto sombreamiento, concordando con lo reportado por Grigoletti Júnior y Garcia (1996), desde donde se expanden en áreas más abiertas.
En el caso más severo, algunas plantas en condiciones de campo presentan defoliación grave, según la escala de Ferretti (1994), aunque se destaca la ausencia de muerte de plantas infectadas con el patógeno.
Los aislados en medio PDA mostraron un crecimiento micelial de color blanco durante los primeros días, tornándose de color amarillento a partir del cuarto día, y de amarillo pálido a naranja en el reverso de la placa de Petri en los días posteriores (Figura 2 A), coincidiendo con las descripciones de Barnett y Hunter (1986), y Crous y Wingfield (1994).
Se observó esporulación en medio PDA a partir de los 12 días de aislamiento (Figura 2 B). Los macroconidióforos consisten en un estípite (25-70 - 4-6 µm) con arreglo peniciliado, septados, hialinos, lisos y con una ramificación (150-300 - 3-4 µm) con terminación clavada o una vesícula simulando una espátula (Figura 2 C y D). Los microconidióforos son no septados o con una septa, hialino, alargados (10-20 - 4-6 µm), peniciliado o subverticilado, el estípite adicional alargado (0-15 - 3-4 µm) no septado o raramente septado de paredes delgadas y terminación en forma de vesícula elipsoidal o periforme. Los conidios cilíndricos, hialino, de 1-3 septos, redondeados en ambos extremos, con tamaños de 48-75-4-5 µm (Barnett y Hunter 1986, Crous y Wingfield 1994, Crous 2002, Lombard et al. 2010).
En la prueba de patogenicidad se observaron los primeros síntomas a partir de las 3 semanas después de la inoculación del patógeno, siendo estos similares a los observados a campo.
En Paraguay es la primera vez que se está reportando esta enfermedad en plantaciones de yerba mate en producción y por lo tanto no se sabe si es esporádica o definitivamente se ha instalado en el cultivo como una nueva enfermedad.