Introducción

El consumo mundial per cápita de banana asciende a 16 kg/habitante/año y las exportaciones mundiales de banano ocupan el primer lugar entre las frutas frescas, tanto en volumen como en valor, de acuerdo con la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación (^{FAO 2017}). Según la ^{FAO (2022)}, el comercio mundial de banano se vio afectado por varios factores en 2021, tanto del lado de la oferta como de la demanda, entre otros: la persistencia de la pandemia del COVID 19, las perturbaciones relacionadas con el clima, las preocupaciones sobre el agravamiento de la propagación de enfermedades de las plantas, las normas más estrictas sobre los niveles máximos de residuos en algunos mercados importantes, además una demanda inferior en varios mercados de importación; por lo tanto, los datos comerciales relativos a ese año indican que el volumen de exportaciones a nivel mundial se redujo en alrededor de 1,7 millones de toneladas en 2021.

El éxito del cultivo se basa fundamentalmente en la implantación de mudas libres de patógenos, por consiguiente, en banano, cuya multiplicación es asexual, se han desarrollado diferentes técnicas de propagación para obtener los propágulos en volumen y calidad adecuada, entre las cuales el cultivo in vitro surge como una opción interesante.

Actualmente, la propagación in vitro de plantas de Musa, vía organogénesis a partir de ápices se mantiene como el método más utilizado (^{Cejas et al., 2011}). Esto se debe, principalmente, a la posibilidad de multiplicar gran cantidad de plantas de calidad, libres de patógenos, en períodos de tiempo y espacio físico reducidos, sin interrupción estacional. Uno de los principales problemas que se han presentado en la micropropagación es la presencia de contaminantes microbianos endógenos (^{Fajardo, 2006}). Al respecto, la desinfección de los explantes es fundamental para esta técnica, y la concentración del desinfectante pude ser determinante para su éxito (^{Díaz Lezcano et al., 2016}).

^{Bogado et al (2015}) refieren que la contaminación microbiana es un problema constante que compromete el desarrollo de todas la técnicas in vitro. Las pérdidas causadas por microorganismos contaminantes principalmente hongos y bacterias constituyen un serio problema a escala mundial en los numerosos laboratorios.

^{Hernández y González (2010}) afirman que entre los microorganismos fungosos comunmente introducidos al cultivo de tejidos Cladosporium, Aspergillus, Penicilium, Fusarium y Curvularia. Asimismo, manifiestan que las bacterias gram negativas como Azospirilum y Xanthomonas son contaminantes frecuentes en el cultivo in vitro de tejidos vegetales.

Para lograr el establecimiento del material vegetal de manera exitosa, libre de contaminación microbiana se utilizan agentes desinfectantes como el hipoclorito de sodio (NaClO), hipoclorito de calcio (CaClO), peróxido de hidrogeno (H2O2), etanol (C2H5OH), y bicloruro de mercurio (HgCl2), entre otros; de los cuales el hipoclorito de sodio ha sido el más usado por los investigadores en el estable- cimiento in vitro de tejidos vegetales (^{Angarita & Perea, 1991}).

Según ^{Muñoz Castellano et al (2022)}, el NaClO y su ingrediente activo, el ácido hipocloroso (HClO), son desinfectantes a base de cloro más utilizados a nivel mundial. El HClO es un anti- microbiano de acción rápida que interactúa con muchas biomoléculas, como aminoácidos, lípidos, ácidos nucleicos y componentes de la membrana que contienen azufre, causando daño celular. El Na ClO puede estar relacionado con un efecto directo sobre el crecimiento del micelio fúngico (Márquez et al, 2016). El cloro puede inhibir hongos (^{Zoffoli et al, 2005}) y puede ser letal en bacterias (^{Owoseni y Okoh 2017}).

Según ^{López Gómez et a (2011}), la susceptibilidad de los explantes al hipoclorito de sodio está asociada al sodio, el mismo es un nutriente no esencial para los los tejidos vegetales además de ser altamente tóxico para muchas plantas.

Por ello, resulta necesaria la realización de más investigaciones sobre el tema con el fin de disipar las interrogantes de este método. El objetivo del trabajo fue evaluar los efectos de la concentración del hipoclorito de sodio sobre la propagación in vitro del banano (Musa spp.) variedad Nanicao.

Materiales y métodos

El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción en San Lorenzo, Paraguay.

Medio de cultivo

En tubos de vidrio (75 x 10 mm), se cargó 2,5 ml del Medio Basal MS suplementado con 15 g/l de sacarosa y gelificado con 4 g/l de ágar, además del agregado de 1 g.l^-1 de carbón activado, 50 mg.l^-1 de mioinositol y 10 mg.l^-1 de glicina, el pH del medio fue ajustado a 5,8, posteriormente autoclavados a 121 °C, 1 atm de presión durante 20 minutos. El protocolo fue propuesto por Díaz Lezcano et al. (2016) para la micropropagación de Musa spp. variedad Nanicao.

Material vegetal y explantes

Los materiales vegetales fueron adquiridos del campo experimental de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción, ubicado en latitud y longitud 25° 21’ 54.80” S y 57° 30’ 8.77” O.

Se utilizaron 80 ápices provenientes de hijuelos de banano, Musa sp. variedade Nanicao, de 30 - 40 cm de altura que fueron obtenidos de la planta madre. Se procedió a la separación del pseudotallo realizando cortes con machete a una altura aproximada de 10 cm por encima de las raíces. Inmediatamente, se procedió a la remoción de las hojas del pseudotallo y los tejidos blancos de la base del cormo. Con ayuda del microscopio estereoscopio, los semicormos fueron sometidos a reducciones hasta obtener un cono aproximadamente de 1 cm, formado por el meristema central y un mínimo del tejido de rizoma para facilitar la manipulación. A medida que iban siendo reducidos, fueron colocados en un frasco que contenía agua destilada para evitar su oxidación.

Desinfección del material vegetal

En la cámara de flujo laminar, previamente desinfectada con alcohol etílico al 70 % y 30 minutos de luz ultravioleta, el explante fue sometido a dos tratamientos de desinfección, propuestos por ^{Ramírez et al. (2002}):

Tratamiento uno

Sumergir los explantes por 30 segundos en alcohol etílico al 70 %, posteriormente a hipoclorito de so- dio al 5 % durante 5 minutos para luego realizarse el triple enjuague con agua destilada estéril.

Tratamiento dos

Sumergir los explantes por 30 segundos en alcohol etílico al 70 %, posteriormente a hipoclorito de sodio al 10 % durante 5 minutos para luego realizarse el triple enjuague con agua destilada estéril.

Establecimiento in vitro de plántulas

En la cámara de flujo laminar, posterior a la desinfección, con ayuda de una pinza previamente flamada fue establecido un explante por tubo, además se aseguró que la base del explante quedara en contacto con el medio, seguidamente fueron sellados los tubos con papel aluminio y parafinado e introducidos en bolsas plásticas negras para final mente ser trasladados a una sala de crecimiento a 25 ºC, 70 % de humedad relativa, en condiciones de fotoperiodo 16:8 horas luz y oscuridad.

Evaluación de variables

Los explantes se observaron a los 15 días posteriores a su inoculación en el medio de cultivo. Las variables medidas fueron:

Porcentaje de supervivencia: se realizó mediante la observación del desarrollo de brotes, siendo considerados como tales si presentan un tamaño aproximado de 2 mm con una coloración blanca verdusca.

Grado de oxidación: se midió considerando las paredes y parte aérea de cada ápice meristemático, mediante la utilización de la escala de cinco grados (Tabla 1) adaptada de ^{Drew & Smith (1990}). Seguidamente, se calculó el grado de oxidación de acuerdo a la fórmula propuesta por ^{French y Hebert (1980}):

GO: grado de oxidación.

N: frecuencia de la severidad observada correspondiente a la nota.

Σn: sumatoria de las observaciones.

Porcentaje de contaminación: se basó en la identificación visual del crecimiento micelial de los hongos o la apariencia lechosa de color blanquecino o amarillo, característico de las bacterias, pudiéndose manifestar ambos patógenos: dentro del medio de cultivo, alrededor del explante en contacto con el medio de cul tivo o saliendo de la meristemo del explante.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se evaluaron dos concentraciones de hipoclorito de sodio para determinar la eficiencia en la desinfección de ápices de Musa spp. con la finalidad de realizar el establecimiento in vitro. Los resultados obtenidos fueron analizados mediante análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa estadístico INFOSTAT para un diseño completamente al azar. Cada tratamiento contó con ocho unidades experimentales y con una repetición en el tiempo. La diferencia de medias entre tratamientos fue analizada mediante el test de Tukey al 5 % de pro babilidad de error (P <0,05).

Resultados y discusión

No se registraron diferencias significativas entre los tratamientos de desinfección aplicados relacionados a la sobrevivencia de explantes de banano cultivados in vitro, aunque existieron diferencias significativas con respecto al grado de oxidación y contaminación microbiana. En este sentido, para el Tratamiento 2 (NaClO al 10%) se observó oxidación de los explantes levemente visible y 25,7 % de contaminación bacteriana. El tratamiento (T1) con hipoclorito de sodio al 5 % presentó incipiente coloración parda sin llegar a la necrosis del tejido y 34,3 % de explantes contaminados con hongos y bacterias.

Al cabo de 60 días de experimentación se logró regenerar 12,5% de los explantes originalmente sembrados, provenientes de ambos tratamientos, registrándose formación de hojas y raices completas. De lo antes referido, se observó el T1 (NaClO al 5%) fue más efectivo en el control de la oxidación de los explantes de Musa spp pero que el T2 (NaClO al 10%) fue más eficiente en la prevención de la contaminación microbiana. Los resultados obtenidos con los tratamientos de desifección se detallan en la Tabla 2.

Uno de los problemas en la supervivencia fue relacionado con los efectos de toxicidad causados por la alta concentración del hipoclorito de sodio, seguido por la contaminación microbiana. En ese sentido, según ^{Montano et al. (2004}), la concentración de hipoclorito de sodio ideal, para desinfectar sumergiendo los explantes de banana durante 10 minutos es del 3 %.

Por su parte, ^{Ramírez et al. (2014}) registraron que con aplicación 2 % de hipoclorito de sodio, durante 15 minutos, se produce la mejor desinfección de los explantes de Guadua angustifolia, además de la mayor sobrevivencia. Ancasi et al. (2014) y ^{Marulanda et al. (2005}) mencionan que, en general, la concentración del hipoclorito de sodio a ser utilizada debe ser del 1 al 3 % para activar la diferenciación celular de los explantes y lograr una buena desinfección.

^{Aguilera Arango et al (2021}) concluyeron que el uso de hipoclorito de sodio al 2,5 % por 10 minutos resultó ser el mejor tratamiento de desinfección de segmento uninodales de Manihot esculenta Crantz variedad Corpoica La Francesa y, ^{Menegazzo et al. (2019}), sostienen que el control de la contaminación microbiana en el cultivo in vitro de Manihot escu lenta se debe en gran parte a la acción superficial del hipoclorito de sodio como agente desinfectante. De lo antes mencionado, las concentraciones superiores al 3 % ocasionan daños fitotóxicos a los tejidos del explante, lo que se traduce en explantes muertos (^{Marulanda et al. 2005}). De acuerdo con varios autores (^{Abdelnour et al. 2011}; ^{Borges et al. 2004} y ^{Del Ángel et al. 2014}), el hipoclorito de sodio es un producto recomendado normalmente para la desinfección in vitro de explantes, pero para algunas especies este compuesto puede ser tóxico. Además, Del Ángel et al. (2014) han reportado que semillas esterilizadas con dicho compuesto, pueden retener suficientes cantidades del agente reactivo como para interferir con la germinación y que, aun lavando el tejido varias veces con agua no se elimina por completo, de esta manera, el cloro residual es absorbido por el tejido.

En ese contexto, el cloro residual afecta la permeabilidad celular de las células vegetales, impidiendo el adecuado desarrollo celular de las células meristemáticas y por lo tanto no genera la brotación del explante (^{Borges et al. 2004}).

Los resultados obtenidos en este experimento, se ajustan a los obtenidos por ^{Alvarenga et al. (2007}), quienes observaron que a mayores porcentajes de hipoclorito de sodio se ocasionaban mayores daños o muerte de explantes debido a los efectos tóxicos casi inmediatamente después de la aplicación.

Contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, ^{Laynez Garsaball y Sánchez}

Cuevas (2006), sostienen que las menores concentraciones de hipoclorito de sodio inducen a mayores porcentajes de sobrevivencia de los explantes, mientras que el porcentaje de sobrevivencia disminuyó en los tratamientos con altas concentraciones de este desinfectante, evidenciando el efecto toxico del hipoclorito en los tejidos.

Por otro lado, una de las dificultades para el establecimiento de cultivos in vitro, es la presencia de microorganismos contaminantes tanto endógenos como exógenos que afectan la viabilidad y el desarrollo de los explantes una vez que se han establecido in vitro, por lo tanto se requiere establecer tratamientos que conlleven a minimizar o eliminar dichos microorganismos sin afectar la viabilidad de los explantes (^{Angarita & Perea, 1991}).

A este respecto, ^{Pereira et al. (2003}) mencionan que la contaminación fúngica en el cultivo in vitro de tejidos vegetales procede principalmente del ambiente, mientras que las bacterias generalmente acompañan al explante y son un indicador de una desinfección deficiente. Así mismo, estos autores afirman que la contaminación bacteriana es más perjudicial, ya que no se detecta de forma temprana y los agentes contaminantes pueden ser trasferidos durante los sub cultivos.

A este respecto, ^{García et al. (2015}) registraron los porcentajes más altos de contaminación, al utilizar hipoclorito de sodio al 5 %, principalmente por la aparición de hongos. Asimismo, resultados similares fueron obtenidos por ^{Arbeláez et al. (2016}), quienes evaluaron diferentes tratamientos de desinfección para el establecimiento in vitro de meristema apical de Musa spp., y constataron que la probabilidad de contaminación por hongos y bacterias es 8,65 veces mayor cuando se utiliza hipoclorito de sodio al 5 %, en contraste con la utilización de hipoclorito de sodio al 10 %.

^{Mongelós Franco et al (2020}) obtuvieron resultados similares en el proceso de desinfección de explantes de banano, siendo el tratamiento con NaClO al 10% durante 5 minutos fue el más efectivo para la desinfección y establecimiento in vitro de meristema apical de Musa sp.

Por su parte, Díaz Lezcano et al (2016), refieren que en la micropropagación de Musa spp. variedad Nanicao los meristemas fueron sometidos a un procedimiento de desinfección por 20 minutos con hipoclorito de sodio al 5 %, resultado un porcentaje de contaminación de los ápices de 39,06 % en la fase de establecimiento, y de 22,39 %.en el primer subcultivo, en tanto que la oxidación en la fase de establecimiento fue de 9,37 % y en el primer subcultivo fue de 8,85 %.

En ese sentido, ^{Sánchez et al. (2009}) mencionan que las soluciones de hipoclorito de sodio que contienen 5 % disponible de cloro, se descomponen rápidamente a 24 °C, por lo cual se pudieron presentar altos niveles de contaminación fúngica. Por el contrario, en el T2, no se registraron hongos contaminantes, este resultado se puede explicar porque el hipoclorito de sodio contribuye a la des infección de los explantes ya que el mecanismo de acción del compuesto permite la deshidratación de los microorganismos, no obstante se registró mayor grado de oxidación.

Sin embargo, en el mencionado tratamiento, se observó finas películas de crecimiento bacteriano a partir del explante formando camino y rodeando el borde del frasco. En ese marco, la contaminación microbiana y la oxidación del tejido donador han sido los problemas más severos que se han enfrentado en la micropropagación de plantas (^{Castro et al., 1993}). En experimentos realizados por Viloria (1993) con varios métodos de desinfección de plantas in vitro no tuvieron éxito y concluyó que la diversidad de la microbiota presente en el material vegetal seleccionado, así como el grado contaminación que caracteriza a las plantas cultivadas en el campo, dificulta la esterilización exitosa de los explantes y su establecimiento in vitro.

Resultados similares fueron reportados por ^{Díaz Lezcano et al (2021}) quienes mencionan que el tratamiento de desinfección de ápices meristemáticos de banano para su establecimiento in vitro, el cual consistió en la inmersión en una solución de NaClO (10 %) durante cinco minuto, registró aproximadamente 21 % de sobrevivencia y 26 % de contaminación microbiana se atribuye a hongos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium, y bacterias Gram negativas. ^{Díaz Lezcano et al (2023)} concluyeron que no existen diferencias significativas atribuibles al tiempo de inmersión de explantes de banano (Musa spp.) sumergidos por 30 segundos en alcohol etílico al 70 %, posteriormente en hipoclorito de sodio al 5 % durante 5 y 10 minutos, en cuanto a contaminación microbiana u oxidación fenólica lo que indica que tanto la concentración del hipoclorito de sodio (5%) y los tiempos empleados en la desinfección son recomendables. Al mismo tiempo, lograron identificar la presencia de los géneros Penicillium y Aspergillus como agentes causales de la contaminación fúngica de los explantes, en ambos tratamientos.

Las investigaciones ^{Pérez Pascual et al (2023}) manifestaron que el protocolo de desinfección de explantes de Brachiaria humidícola se optimizó al utilizar una mezcla de fungicida y bactericida además de la utilización de hipoclorito de sodio al 20 % y etanol al 70 % no es suficiente para la desinfección del tejido; sin embargo, se incrementó el porcentaje de necrosis de los segmentos nodales. Esto último se debe al efecto fitotóxico del que produce el hipoclorito de sodio y el etanol.

Finalmente, una desinfección eficaz es aquella en la que los explantes que han sido expuestos a una baja concentración desinfectante, presentan tasas reducidas de contaminación microbiana y oxidación permitiendo el desarrollo de los explantes (^{Alves et al. 2010}), aspectos que no fueron observados en este experimento, con ambos tratamientos.

Conclusión

En las condiciones de los ensayos aplicados se observó que al incrementar la concentración de hipoclorito de sodio, el porcentaje de explantes contaminados con hongos y bacterias fue menor, sin embargo, esto se tradujo en un incremento del grado de oxidación de explantes de Musa spp.

Contribución de los autores

Todos los autores contribuyeron de manera equitativa en la elaboración de este artículo.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción por el apoyo financiero para la realización de los ensayos