INTRODUÇÃO

O uso de sementes de qualidade propicia melhor estabelecimento da cultura e maior potencial produtivo, dessa forma, o conhecimento sobre sementes é imprescindível. Segundo Araújo e Araújo (2015) o conceito de sementes de qualidade é expresso pelo atributo genético, físico, fisiológico e sanitário. O atributo fisiológico refere-se à longevidade da semente e sua capacidade de gerar uma planta perfeita, que pode ser aferida pelo poder germinativo e vigor (^{Araújo e Araújo 2015}, ^{Vazquez e Sá 2015}).

Vários fatores afetam o vigor da semente durante a produção, colheita, armazenamento e emergência no campo. Durante a produção, os principais fatores são: condições climáticas (temperatura e água), nutrientes e intensidade luminosa (^{Carvalho e Nakagawa 2012}).

A quantidade de água disponível no solo durante o desenvolvimento da semente pode afetar indiretamente o vigor, por influenciar a composição química quantitativa da semente (^{Carvalho e Nakagawa 2012}). A ocorrência de deficiência hídrica no período de transferência de matéria seca pode provocar redução no peso das sementes e afetar de forma significativa o seu desempenho. Além disso, a deficiência hídrica acelera a senescência foliar e diminui o período de acúmulo de reservas, fazendo com que as sementes oriundas das plantas estressadas não apresentem padrão normal de desenvolvimento (^{Marcos-Filho 2005}).

No que se refere a adequada nutrição das plantas de feijão, a disponibilidade de nutrientes influencia a formação do embrião e dos cotilédones, interferindo sobre o vigor e a qualidade fisiológica (^{Teixeira et al. 2005}). Dentre os nutrientes, o nitrogênio (N) tem ação mais visível e pronunciada na qualidade da semente (^{Marcos Filho 2005}), no entanto, os resultados variam em função da espécie, das condições ambientais, como também do estádio de desenvolvimento da planta no momento da aplicação do nutriente (^{Carvalho e Nakagawa 2012}). Por questões econômicas e ambientais pelo uso do nitrogênio mineral, são necessárias técnicas alternativas para o fornecimento do N para a cultura do feijão, a qual cita-se as bactérias fixadoras de N.

A fixação biológica de N (FBN) representa a forma mais importante de fixar o N atmosférico em amônio (^{Taiz e Zeiger 2013}). Essa reação de FBN é realizada por microrganismos procarióticos conhecidos como diazotróficos, que podem ser de vida livre, estar associados a espécies vegetais ou, estabelecer simbiose com leguminosas (^{Moreira et al. 2010}). Na associação com leguminosas, a bactéria é denominada de rizóbio, tendo como característica principal a capacidade de interação com o sistema radicular da planta hospedeira por meio do desenvolvimento de estruturas altamente especializadas, o nódulo radicular, local onde ocorre a FBN (^{Cassini e Franco 2006}). A inoculação de bactérias do grupo dos rizóbios é uma alternativa que pode substituir, mesmo que em parte, a adubação nitrogenada no feijoeiro (^{Straliotto R. et al. 2003}), podendo beneficiar a qualidade fisiológica das sementes.

Além das bactérias do gênero Rhizobium, existem outras que também são utilizadas visando o suprimento de N para a cultura. Segundo ^{Bashan e Bashan (2005}) bactérias do gênero Azospirillum são classificadas como bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCPs) e são as mais conhecidas entre as não simbióticas, assim também elas promovem o crescimento da planta por diversos mecanismos, como a fixação de N e produção de hormônios de plantas (auxina, giberelina e citocinina).

Uma técnica alternativa de co-inoculação ou também denominada de inoculação mista com bactérias simbióticas e assimbióticas tem sido estudada em leguminosas. Essa técnica consiste na utilização de combinações de diferentes microrganismos, os quais produzem efeito sinérgico, em que se superam os resultados produtivos obtidos quando utilizados na forma isolada (^{Ferlini 2006}, ^{Bárbaro et al. 2008}). ^{Burdman et al. (1997}), avaliando o efeito de Azospirillum e Rhizobium sobre a nodulação e crescimento do feijoeiro em laboratório, observaram que a co-inoculação aumentou o número total de nódulos e a fixação de N comparados com a inoculação apenas com Rhizobium.

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade fisiológica de sementes, oriundas do cultivo de feijão submetido à inoculação e co-inoculação com Rhizobium tropici e Azospirillum brasilense sob duas lâminas de irrigação.

MATERIAL E MÉTODOS

A primeira parte da pesquisa foi realizada no período de outono/inverno dos anos de 2012 e 2013, na Fazenda de Ensino e Pesquisa da Faculdade de Ilha Solteira - UNESP, localizada no município de Selvíria, estado de Mato Grosso do Sul, que tem como coordenadas geográficas aproximadas de 51°24’ O e 20°20’ S e 340 metros de altitude. O solo original da área é um Latossolo Vermelho Distrófico, textura argilosa, segundo a classificação de ^{Santos et al. (2013}).

O clima predominante da região, conforme classificação de Koppen é do tipo Aw, definido como tropical úmido com estação chuvosa no verão e seca no inverno. De acordo com ^{Portugal et al. (2015}), a precipitação pluvial média anual é de 1.313 mm, temperatura média mínima de 19°C e máxima de 31°C. Os dados climáticos de temperatura mínima e máxima e precipitação registrados durante a condução do experimento estão na Figura 1. A precipitação total acumulada em 2012 foi de 94 mm e em 2013 de 155 mm.

Antes da instalação do experimento, em 2012, foi coletada amostra de solo da área na camada de 0-0,20 m para análise química. Os resultados revelaram: P (resina) = 12,4 mg dm^-3, M.O.=16,4 g dm^-3, pH (CaCl₂) = 5,0; K, Ca, Mg, H +Al, SB e CTC = 1,5; 18,2; 11,8; 18,2; 31,5 e 49,7 mmol_c dm^-3, respectivamente e V = 63%. Nos dois anos foi utilizada áreas com fertilidade semelhantes, tendo o milho como cultura antecessora e semeado no sistema convencional de manejo de solo.

O delineamento experimental foi em blocos casualizados com tratamentos dispostos em esquema de parcelas subdivididas. Nas parcelas foram alocadas as duas lâminas de irrigação (recomendada para o feijão e 75% da recomendada) e nas subparcelas foram alocadas as cinco formas de fornecimento de nitrogênio (testemunha sem inoculação com 40 kg ha^-1 de N em cobertura; 80 kg ha^-1 de N em cobertura sem inoculação; inoculação de A. brasilense com 40 kg ha^-1 de N em cobertura; inoculação de R. tropici com 40 kg ha^-1 de N em cobertura; e co-inoculação de A. brasilense e R. tropici com 40 kg ha^-1 de N em cobertura), com quatro repetições.

As unidades experimentais foram constituídas por cinco linhas de 6,2 m de comprimento, espaçadas 0,50 m entre si no ano de 2012 e 0,45 m em 2013. A área útil foi considerada as três linhas centrais de cada unidade experimental.

O feijão foi semeado mecanicamente, nos dias dois de maio em 2012 e 22 de maio em 2013, respectivamente, utilizando a cultivar Pérola, com a quantidade de sementes suficientes para obtenção de 10 e 13 plantas m^-1. Não foi realizado o tratamento químico das sementes. A adubação de semeadura foi de 250 kg ha^-1 da fórmula 04-30^-1-0 nos dois anos de cultivo. No segundo ano, o experimento foi alocado em área com a mesma fertilidade do primeiro ano de cultivo.

Na inoculação das sementes com Rhizobium tropici utilizou-se inoculante comercial turfoso com a estirpe Semia 4080, na dose de 200 g para 25 kg de sementes. A inoculação com Azospirillum brasilense foi realizada com o inoculante comercial turfoso que contém as estirpes AbV₅ e AbV₆, na dose de 200 g para 25 kg de sementes no ano de 2012 e, no ano de 2013 utilizou-se inoculante líquido para gramíneas que também contém as mesmas estirpes (AbV₅ e AbV₆) na dose de 200 mL para 25 kg de sementes. A co-inoculação foi realizada misturando as duas bactérias, nas mesmas proporções utilizadas quando inoculadas isoladamente, ou seja, 200 g (ou 200 mL) de inoculante contendo A. brasilense + 200 g de inoculante contendo R. tropici para 25 kg de sementes. A inoculação foi realizada misturando o inoculante com solução açucarada a 12% na proporção de 250 mL da solução para cada 500 g de inoculante.

A emergência das plântulas ocorreu aos sete dias em 2012 e seis dias em 2013, após a semeadura. A adubação nitrogenada de cobertura foi realizada aos 24 e 20 dias após a emergência (DAE) nos anos de 2012 e 2013, respectivamente, quando as plantas estavam no estádio V_4-4 (quarta folha trifoliada). Utilizou-se a ureia como fonte de nitrogênio. Logo após a adubação em superfície e nas entrelinhas, a área foi irrigada para diminuir as perdas por volatilização da amônia.

O fornecimento de água foi realizado por um sistema fixo de irrigação convencional por aspersão com precipitação média de 3,3 mm h^-1 nos aspersores. A reposição de água foi realizada quando a evapotranspiração da cultura (ETc) acumulada atingiu valores próximos da água disponível do solo (ADS) preestabelecidos. A evaporação de água (ECA) foi obtida diariamente do tanque classe A instalado no Posto Meteorológico distante 500 m da área experimental. O coeficiente do tanque classe A (Kp) utilizado foi 0,7 que foi proposto por ^{Doorenbos e Pruitt (1976}).

No manejo de água da cultura para a lâmina recomendada, foram utilizados coeficientes de cultura (Kc) de 0,30; 0,70; 1,05; 0,75 e 0,25 (^{Doorenbos e Kassam 1979}) para as fases de desenvolvimento: germinação - folhas primárias (V0 - V2); primeira folha trifoliada - terceira folha trifoliada (V3 -V4); prefloração - formação de vagens (R5 - R7); enchimento de vagens (R8) e maturação (R9) (Fernandez et al. 1986), respectivamente. Na lâmina de 75% da recomendada os valores dos coeficientes de cultura Kc foram 25% inferior em relação ao Kc da lâmina recomendada.

A colheita foi realizada manualmente aos 89 DAE em 2012 e 81 DAE em 2013. A segunda parte da pesquisa foi realizada no laboratório de análise de sementes da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira (FEIS/UNESP).

Foi realizado o teste de germinação com quatro subamostras de 50 sementes, em rolos de papel germitest mantidos a temperatura constante de 25±1°C. O papel foi umedecido com água destilada numa quantidade equivalente a três vezes o peso do papel. As contagens de plântulas normais foram realizadas aos cinco e nove dias após a instalação do teste, de acordo com os critérios estabelecidos pelas Regras de Análise de Sementes (^{MAPA 2009}). Os resultados foram expressos em porcentagem de plântulas normais. Segundo MAPA (2009), plântulas normais são aquelas que alcançaram o estádio em que todas as suas estruturas essenciais estão bem desenvolvidas, completas, proporcionais e sadias (sistema radicular bem desenvolvido - raiz primária longa e delgada geralmente revestida por numerosos pelos absorventes e terminando numa extremidade afilada e raízes secundárias produzidas dentro do período de duração do teste; parte aérea bem desenvolvida; cotilédones - dois cotilédones em dicotiledôneas; folhas primárias verdes e em expansão).

A primeira contagem de germinação foi conduzida juntamente com o teste de germinação e constou do registro das plântulas normais determinadas na primeira contagem, avaliada aos cinco dias após a semeadura. Os resultados foram expressos em porcentagem de plântulas normais.

A emergência em campo foi realizada utilizando-se quatro repetições de 50 sementes por tratamento, semeadas em linha de dois metros de comprimento com espaçamento entrelinhas de 0,25 m, sendo irrigadas diariamente. As contagens foram efetuadas 14 dias após a semeadura e os resultados expressos em porcentagem.

O envelhecimento acelerado foi realizado segundo metodologia descrita por ^{Marcos-Filho (1999}), utilizando-se quatro subamostras de 50 sementes para cada tratamento, pelo método de gerbox, onde aproximadamente 200 sementes foram colocadas sobre a tela de inox de uma caixa plástica (gerbox), contendo no fundo 40 mL de água deionizada. Após a colocação da tampa, as caixas foram levadas ao germinador regulado à temperatura de 42°C, onde permaneceram por 72 horas. Transcorrido esse período, as sementes foram submetidas ao teste de germinação e as plântulas normais foram avaliadas após cinco dias. Os resultados foram expressos em porcentagem de plântulas normais.

A condutividade elétrica foi realizada segundo o método descrito por ^{Marcos Filho (2005}), utilizando quatro repetições de 50 sementes por tratamento, cujas massas foram previamente determinadas. Após a determinação da massa de cada amostra, as sementes foram colocadas em copos plásticos contendo 75 mL de água deionizada, mantidas em germinador a temperatura de 25±1°C, durante 24 horas. Decorrido esse período, a condutividade da solução de embebição foi determinada com o uso do condutivímetro modelo CD-20. Posteriormente, o valor encontrado foi dividido pela massa da amostra (g) e os resultados foram expressos em μS cm^-1 g^-1 de sementes.

Para o comprimento de plântula preparou-se o substrato de maneira semelhante ao teste de germinação (MAPA 2009). Em seguida, quatro repetições de 20 sementes foram distribuídas sobre duas linhas no terço superior do papel. Os rolos foram confeccionados e colocados em pé, inclinado com ângulo de 75°, dentro do germinador e mantidos a temperatura constante de 25±1°C por cinco dias. Após esse período, foi determinado o comprimento de 10 plântulas normais por repetição, com auxílio de uma régua, considerando a ponta da raiz até a inserção dos cotilédones. O comprimento médio de plântulas foi calculado dividindo-se a soma das medidas de cada repetição por 10 e os resultados foram expressos em mm plântula^-1 (^{Nakagawa 1999}).

Após a avaliação do teste de comprimento de plântulas, as 10 plântulas normais mensuradas foram utilizadas para esse teste massa seca de plântulas, onde os cotilédones foram retirados e posteriormente as plântulas foram secas em estufa de circulação de ar regulada a 65°C até atingir massa constante e pesadas em balança de precisão (0,001 g). A massa seca de plântulas foi obtida dividindo-se a massa total de plântulas de cada repetição pelo número de plântulas avaliadas e os resultados expressos em mg plântula^-1 (^{Nakagawa 1999}).

Os dados foram avaliados por meio da análise de variância pelo teste F. Quando o valor de F foi significativo ao nível de 5% de probabilidade, aplicou-se o teste de Tukey para comparação das médias. A análise estatística foi realizada através do software SISVAR (^{Ferreira 2011}).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A germinação média em 2012 foi de 94% e em 2013 de 93%, estando dentro dos padrões comerciais, em que a germinação mínima exigida é de 80% (^{Instrução Normativa N° 45 2013}). A germinação das sementes de feijão não foi influenciada pela forma de fornecimento de nitrogênio nos dois anos de cultivo, porém foi afetada pela lâmina de irrigação em 2012 (Tabela 1). A aplicação de 75% da lâmina de irrigação recomendada no feijoeiro em 2012 resultou em produção de sementes com maior germinação em relação à lâmina recomendada. Dados semelhantes foram obtidos por ^{Bassan et al. (2001}), que não verificaram influência da inoculação com R. tropici na germinação de sementes do feijoeiro. Da mesma forma, ^{Meira et al. (2005}), e ^{Barbosa et al. (2011}), não observaram diferença na germinação de sementes de feijão com as doses de N. No entanto, Farinelli et al. (2006), relataram respostas a adubação nitrogenada em cobertura, em que a germinação ajustou-se a função linear crescente com as doses 0, 40, 80, 120 e 160 kg ha^-1 de N, proporcionando aumento na germinação das sementes com o aumento das doses de N. ^{Goes et al. (2009}), ao avaliar a germinação em função do manejo de irrigação utilizado e doses de N em cobertura, não observaram diferenças.

Nos dois anos de cultivo, a primeira contagem de germinação foi afetada pela forma de fornecimento de nitrogênio (Tabela 1). Em 2012, a testemunha com 40 kg ha^-1 de N em cobertura, inoculação com A. brasilense e co-inoculação originaram maior porcentagem de plântulas normais na primeira contagem. Já em 2013, ocorreu diferença apenas entre a testemunha com 40 kg ha^-1 de N e co-inoculação, em que a testemunha foi capaz de resultar maior porcentagem de plântulas normais. A lâmina de irrigação não interferiu na primeira contagem de germinação. Diferente do que ocorreu neste experimento, ^{Meira et al. (2005}), e ^{Barbosa et al. (2011}), em experimento com doses de N aplicados em cobertura, relataram que não ocorreu diferenças na primeira contagem de germinação.

Para a emergência de plântulas, não houve efeito da forma de fornecimento de nitrogênio e lâminas de irrigação (Tabela 1). Da mesma forma, ^{Bassan et al. (2001}), também não observaram diferença na emergência em campo com a inoculação com R. tropici.

A análise estatística para o teste de envelhecimento acelerado pode ser observada na Tabela 2. Não se verificou diferença entre os resultados do teste para nenhum dos fatores avaliados, não evidenciando diferenças no vigor. ^{Bassan et al. (2001}), também não obtiveram diferenças no teste de envelhecimento acelerado com a inoculação de R. tropici. De forma semelhante, em experimento realizado por ^{Gomes-Júnior e Sá (2010}), não ocorreu diferenças nos resultados do envelhecimento acelerado com as doses de 0, 30, 60, 90 e 120 kg ha^-1 de N aplicados em cobertura. ^{Meira et al. (2005}), e ^{Barbosa et al. (2011}), também não observaram efeito de doses de N aplicadas em cobertura no vigor das sementes, obtido com o teste de envelhecimento acelerado.

Para a condutividade elétrica houve efeito significativo da interação entre forma de fornecimento de nitrogênio e lâminas de irrigação (Tabela 2). Este teste estabelece que sementes menos vigorosas, ou seja, mais deterioradas, liberam maiores quantidades de solutos durante a embebição, devido a menor velocidade de restabelecimento da integridade das membranas celulares durante este período e, portanto, originam leituras superiores (^{Marcos-Filho 2005}).

Para o desdobramento em 2012, observa-se que na lâmina recomendada não houve diferença entre as formas de fornecimento de nitrogênio, enquanto que na lâmina de 75% da recomendada, a testemunha com 40 kg ha^-1 de N em cobertura e a inoculação de A. brasilense originaram sementes mais vigorosas que a inoculação com R. tropici. A testemunha com 40 kg ha^-1 de N associada a 75% da lâmina recomendada, a testemunha com de 80 kg de N ha^-1 em cobertura e a inoculação com R. tropici associadas a lâmina recomendada foram capazes de produzir sementes mais vigorosas (Tabela 3).

Em 2013, o desdobramento demonstrou, na lâmina recomendada, que a aplicação de 80 kg ha^-1 de N em cobertura resultou em maior vigor. Já na lâmina de 75% da recomendada, a aplicação de 80 kg ha^-1 de N em cobertura também proporcionou maior vigor diferindo apenas de A. brasilense. Nota-se que a testemunha com 40 kg ha^-1 de N em cobertura, R. tropici e co-inoculação associados com 75% da lâmina recomendada e A. brasilense associado com a lâmina recomendada obtiveram menor valor de condutividade elétrica, portanto maior vigor (Tabela 3). Por outro lado, ^{Farinelli et al. (2006}) e ^{Barbosa et al. (2011}) não verificaram efeito de doses de N em cobertura sobre a condutividade elétrica de sementes de feijão.

O comprimento de plântulas e a massa seca de plântulas foram influenciados pela interação entre forma de fornecimento de nitrogênio e lâminas de irrigação nos dois anos do experimento (Tabela 4).

No desdobramento, para o comprimento de plântulas em 2012, na lâmina recomendada, a inoculação com R. tropici resultou maior vigor em relação a inoculação com A. brasilense, enquanto que na lâmina de 75% da recomendada, não houve diferenças. Já a inoculação com A. brasilense associada à lâmina recomendada e a inoculação com R. tropici e a co-inoculação associadas a 75% da lâmina recomendada reduziram o comprimento das plântulas (Tabela 5).

Analisando o desdobramento para o comprimento de plântulas em 2013, verifica-se que na lâmina recomendada, a testemunha com 40 kg ha^-1 de N em cobertura propiciou maior vigor que a co-inoculação. Na lâmina de 75% da recomendada, a testemunha com 40 kg ha^-1 de N em cobertura proporcionou o maior valor comparado ao A. brasilense e ao R. tropici. Nota-se que na co-inoculação a lâmina de 75% da recomendada resultou em maior comprimento de plântulas em comparação com a lâmina recomendada (Tabela 5).

Observando a massa seca de plântulas em 2012, verifica-se que na lâmina recomendada, o maior valor foi obtido com a aplicação de 80 kg ha^-1 de N em cobertura (testemunha) em relação ao A. brasilense. Na lâmina de 75% da recomendada, também se obteve maior valor com a aplicação de 80 kg ha^-1 de N em cobertura (testemunha), não apresentando diferença de A. brasilense. A inoculação de A. brasilense com 75% da lâmina recomendada e inoculação com R. tropici e co-inoculação com a lâmina recomendada apresentaram valores superiores de massa seca de plântulas em 2012 (Tabela 6).

A massa seca de plântulas em 2013, na lâmina recomendada propiciou menor valor com a co-inoculação e, na lâmina de 75% da recomendada não houve diferença entre os tratamentos de forma de fornecimento de nitrogênio. Verifica-se que a co-inoculação associada a lâmina de 75% da recomendada apresentou maior massa seca de plântulas do que em associação a lâmina recomendada (Tabela 6).

Observa-se grande variabilidade nas respostas obtidas com a inoculação do feijoeiro. De acordo com ^{Cassini e Franco (2006}) o principal fator é a existência generalizada e diversificada de bactérias nativas no solo, que competem com as bactérias inoculadas e interagem diferencialmente com os diversos cultivares utilizados, acarretando variabilidade da resposta à nodulação e à FBN.

CONCLUSÕES

O cultivo do feijoeiro com aplicação de 40 kg ha^-1 de N em cobertura sem inoculação proporciona qualidade fisiológica de sementes satisfatória, não havendo a necessidade de aplicação de maiores doses de nitrogênio e inoculação com R. tropici, inoculação com A. brasilense e co-inoculação com R. tropici e A. brasilense. Ainda, nas condições desse experimento, sementes de feijoeiro podem ser produzidas com a lâmina de 75% da recomenda, sem resultar em diminuição da sua qualidade.