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Introducción
La leishmaniasis cutánea (LC) es una enfermedad zoonótica, de naturaleza parasitaria que se transmite al hombre y a los animales a través de la picadura de insectos dípteros de los géneros Phlebotomus (en el Viejo Mundo) y Lutzomyia (en el Nuevo Mundo) infectados con diferentes especies de protozoos del género Leishmania1.
En América Latina el agente etiológico predominante es la especie L. (V) Braziliensis2-4 responsable de provocar en el hombre diversas presentaciones clínicas que van desde pequeñas lesiones cutáneas hasta formas más graves con destrucción de los tejidos circundantes, comprometiendo las membranas mucosas de nariz y boca5.
Esta parasitosis es considerada una de las enfermedades infecciosas más importantes y desatendidas a nivel mundial, cuya complejidad en el ciclo de transmisión se debe a la amplia variedad de especies de vectores, parásitos y huéspedes implicados en la presentación de la enfermedad6,7.
Si bien se han descripto numerosos mamíferos infectados naturalmente con especies de Leishmania8-13, su identificación en roedores silvestres y marsupiales sugiere que estos vertebrados cumplirían el rol de reservorios naturales de la leishmaniasis dermotrópica3,14-18.
Por su parte, el Rattus rattus es una especie cosmopolita con una gran adaptación tanto en ambientes urbanos como periurbanos y rurales, lo que le proporciona a los flebotomínos una fuente importante de alimento mediante un contacto continuo entre el reservorio y sus vectores19, atributos que permitirían el mantenimiento de esta enfermedad en diferentes escenarios.
La Provincia de Corrientes es una de las provincias del nordeste Argentino con presentación endémica de leishmaniasis cutánea donde los casos en humanos se presentan tanto en la ciudad capital como en numerosos departamentos del interior20. Hasta el momento se ha reportado un solo trabajo en todo el territorio Argentino sobre detección de Leishmania spp. en roedores de la ciudad de Corrientes21 por lo que el presente trabajo tiene como objetivo complementar esta información identificando la especie de leishmania que circula en roedores sinantrópicos qua habitan el área urbana de la ciudad de Corrientes mediante técnica de biología molecular a partir de muestras de piel de oreja ya que se ha comprobado que las área desprovista de pelo (oreja y base de la cola) facilitarían la alimentación de los flebótomos22,23 lo que permitiría en futuras investigaciones realizar estudios epidemiológicos en animales tanto silvestres como domésticos empleando métodos menos invasivos sin tener que recurrir al sacrificio del animal.
Materiales y métodos
Área de estudio
El estudio se llevó a cabo en los barrios Molina Punta, Anahí, Quinta Ferre y Pujol pertenecientes a la zona urbana de la ciudad de Corrientes. Estos barrios presentan áreas con intensa vegetación, humedad y presencia de colchones de hojarascas, condiciones favorables para la proliferación de Lutzomya sp. Así mismo, si bien cuentan con servicio de recolección de basuras, estos no llegan a cubrir el total de los barrios, observándose focos de basurales espontáneos que sirven de alimentación y proliferación de roedores.
Captura de animales y Recolección de muestras
Los puntos de muestreo fueron seleccionados por conveniencia en base a los casos reportados de leishmaniasis cutánea o leishmaniasis visceral en humanos y caninos (datos no publicados pero registrados en la dirección de zoonosis de la Municipalidad de la ciudad de Corrientes en las viviendas, o en cercanías a ellas), estando limitado el muestreo a aquellos hogares donde se logró el consentimiento por parte de los habitantes de la viviendas.
Para la captura de los animales se emplearon jaulas trampas tipo Sherman empleando como cebo semilla de zapallo o grasa bovina. Luego de la captura, los animales fueron trasladados a la cátedra de Salud Pública de la facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional del Nordeste donde se procedió a la anestesia de los mismos con ketamina-Xilaxina (protocolo aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias Veterinarias) para su identificación y procesamiento.
La identificación taxonómica se llevó a cabo mediante parámetros morfométricos de cabeza, cuerpo y cola según clave Osgood (1943)24. Seguidamente se realizó la inspección general del animal en búsqueda de alopecias, descamaciones y/o lesiones cutáneas compatibles con leishmanias dermotrópicas.
Por último, se efectuó la eutanasia de los ejemplares aplicando pentobarbital intraperitonal y posterior muestreo mediante pequeñas incisiones de piel de oreja (aproximadamente 0,5cm2) las que fueron conservadas en tubos eppendorf estériles a -20°C hasta su procesamiento. Cabe aclarar que la eutanasia de estos animales se llevó a cabo debido al muestreo de diferentes órganos utilizados como parte del proyecto general del cual se desprende el presente trabajo.
Extracción de ADN
La obtención de ADN de las muestras de piel se realizó mediante técnica de extracción por digestión con detergente CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) y purificación con cloroformo: alcohol isoamílico21.
Detección de Leishmania spp. por Nested PCR
Se aplicó la tecnica de Nested PCR descripta por Uliana et. al. (1994)25) modificada por nuestro equipo de trabajo21 empleandose para la primera ronda de amplificación los iniciadores externos S4 (5’- GAT CCA GCT GCA GGT TCA CC -3’) y S12 (5’- GGT TGA TTC CGT CAA CGG AC -3’) que generan fragmentos de 520 pb. En la segunda ronda en cambio, se utilizaron los iniciadores internos S17 (5’- CCA AGC TGC CCA GTA GAA T -3’) y S18 (5’- TCG GGC GGA TAA AAC CC -3’) dando como producto fragmentos de 490 pb.26 Para la amplificación de esta última ronda se utilizaron 1 µl del producto de amplificación de la primera PCR en 19 µl de reacción.
La elaboración de los master mix y programas de ciclado se llevaron a cabo según las recomendaciones propuestas por Uliana et. al. (1994)25) empleando como control positivo ADN de Leishmania spp. provenientes del Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chaben”, Argentina, y agua tridestilada estéril como control negativo.
Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 2% y buffer TBE1X, teñidos con bromuro de etidio y visualizados por transiluminación UV. Se utilizó un marcador de peso molecular (Ladder 100) para la comparación de tamaños de los fragmentos amplificados.
PCR Simple para Detección de Leishmania braziliensis
Las muestras positivas a Leishmania spp. por Nested PCR, fueron sometidas a una PCR simple a los efectos de determinar si corresponden a la especie L. braziliensis, empleandose en esta oportunidad los iniciadores b1 (5’- GTG GGC GTA TCT GCT GAT GAC -3’) y b2 (5’- CAA AAA GCG AGG GAC TGC GGA -3’) que amplifican bandas de 103 pb. Las condiciones de PCR empleadas para esta técnica consistieron en un volumen de 25 µl de reacción conteniendo las siguientes concentraciones finales de reactivo: 1X de buffer de PCR, 0,2 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTPs, 0,25 µM de cada iniciador, 2 U de Taq ADN polimerasa y 2 µl de ADN de muestra. El programa de ciclado consistió en una desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 minutos seguida de 35 ciclos consistentes en desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 70 °C por 90 segundos y extensión a 72 °C por 90 segundos, finalizando con una extensión final de 72 °C - 10 minutos e incubación a 4 °C27. Como control positivo se utilizó ADN de L. (V) braziliensis provista por el Centro Nacional de Parasitología y Enfermedades Tropicales de la Ciudad de Corrientes - CENPETROP (cedida gentilmente por el Dr. C. Borda), y agua tridestilada estéril como control negativo.
Por último, los productos resultantes de esta PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 2% y buffer TBE1X, teñidos con bromuro de etidio y visualizados por transiluminación UV, empleando como marcador de peso molecular Cienmarker (Biodynamics).
Resultados
Se analizaron un total de 30 muestras de piel de oreja de roedores de la especie Rattus rattus.
Discusión
En el presente, identificar huéspedes vertebrados como reservorio de leishmanias sigue siendo un desafío de difícil esclarecimiento no solo por las múltiples especies de flebótomos y mamíferos que intervienen en la epidemiologia de esta enfermedad sino también por la dificultad de captura de los animales a campo y las herramientas empleadas para la detección e identificación de especies de leishmanias.
En roedores sinantrópicos, la infección natural por especies de leishmanias cutáneas ya han sido descriptas en numerosos países de América Latina3,19,28-31 sin embargo pocos son los estudios realizados en Rattus rattus en el que se identifica a la especie Leishmania braziliensis como agente etiológico presente en áreas urbanas, endémicas a leishmaniasis cutánea.
Los resultados obtenidos en este trabajo representan el primer reporte de L. braziliensis en tejido extraído de las orejas de roedores de la especie Rattus rattus que habitan la zona urbana de la ciudad de Corrientes donde, en los últimos años, se vienen reportando casos de leishmaniasis visceral canina y leishmaniasis tegumentaria en humanos, con escasa información sobre la identificación de especie que afecta a estos últimos.
En nuestra investigación, a la observación clínica, ninguno de los ejemplares capturados mostro señales de alopecia, despigmentación y/o presencia de lesiones compatibles con leishmania cutánea, dejando en evidencia que las especies de leishmania pueden ser detectadas en muestras de piel aparentemente normal lo que indicaría que el patógeno puede estar presente incluso en ausencia de lesiones, atributo que según OMS (2010)32 le confiere a estos mamíferos el papel de excelentes reservorios de esta parasitosis. Andrade et. al. (2015)23 por su parte, sostienen que la falta de signos clínicos en roedores infectados de forma natural podría deberse a la rápida recuperación en estos mamíferos, estando ausentes en el momento de realizar la observación clínica de los ejemplares lo que explicaría porque algunos trabajos señalan haber observado durante investigaciones animales con lesiones cutáneas presentes6,16,23,28,29 mientras que en otros trabajos no se observaron lesiones, aun cuando se detectó la presencia de especies de leishmanias dermotrópicas31,32.
Por último, si consideramos únicamente los trabajos donde identifican a la especie L. braziliensis en estos mamíferos, las tasas de infección son muy variadas en comparación a los obtenidos en nuestra investigación en donde se detectó un 16,7% (5/30) de Rattus rattus infectados a Leishmania spp., de los cuales 6,7% (2/30) fueron identificados como L. braziliensis. Entre los estudios reportados se pueden mencionar los trabajos realizados en Brasil por Brandão-Filho et. al. (2003) 19 en el estado de Pernambuco y Quaresma et. al. (2011) 34 en Belo Horizonte, ambas áreas rurales endémicas a leishmaniasis cutánea, a partir de diferentes muestras (sangre, bazo, piel, cola y medula ósea) de roedores tanto silvestres como sinantrópicos quienes si bien informaron 18,7% (38/203) y 22,2% (16/72) de roedores positivos a Leishmania spp., solo el 1,3% y 1,4% correspondían a L. braziliensis. Así mismo, se han informaron tasas de infección más altas en las investigaciones realizadas por Pereira et. al. (2017)12 donde se detectó un 20% de ADN de Leishmania spp. en diferentes muestras (piel de oreja y cola, hígado, bazo y medula ósea), abarcando 16% la especie L. braziliensis. Sin embargo, los valores más altos fueron registrados por Ferreira et. al. (2015)6 quienes informaron tasas de infección del 47,4% en Rattus rattus y 83.3% en Mus musculus de los cuales 54% de las muestras positivas pertenecieron al complejo L. braziliensis. Tal como lo mencionan Marcelino et. al. (2011)29 las diferencias en la tasa de infección de estos reportes en comparación con nuestros resultados podrían atribuirse a factores asociados al área de estudio (endémico, urbano, selvático), momento epidemiológico en que se capturaron los animales, especies de roedores analizadas, tipo y número de tejidos evaluados y técnica empleada entre otros.
Podemos concluir que, si bien la prevalencia hallada en el presente trabajo no es alta, por lo cual no podemos considerar animales reservorios, si se evidencia una infección natural que no afecta clínicamente a los roedores estudiados con circulación del parásito en piel, particularmente de la especie Leismania braziliensis. Por otro lado, las especies capturadas pertenecen a zona urbana de la ciudad de Corrientes, lo que se considera una característica epidemiológica de importancia en Salud Pública dado el estrecho contacto de esta especie animal con el hombre.
