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INTRODUCCIÓN
La infección por C. difficile es una de las principales causas de diarrea nosocomial en los hospitales del mundo, relacionada a la colitis pseudomembranosa asociada al uso de antibióticos de amplio espectro1,2. La epidemiología de la infección por C. difficile (ICD) ha cambiado durante este milenio, así como la presentación clínica, la aparición de la infección en pacientes con bajo riesgo, y la respuesta al tratamiento antimicrobiano1,3. El espectro de la enfermedad va desde cuadros discretos de diarrea hasta la formación de pseudomembranas y megacolon tóxico. Estos cuadros clínicos se deben a los factores de virulencia que presenta este patógeno, principalmente la toxina A y toxina B que son responsables de la patogenicidad4-6.
La presencia de esporas en la estructura de C. difficile lo hacen resistentes a los cambios físicos, altas temperaturas, luz ultravioleta y desinfectantes. Se transmite por la vía fecal-oral, pudiendo propagarse por las manos de pacientes infectados y trabajadores de la salud y hasta después de su egreso hospitalario, lo que podría generar brotes en hospitales y comunidad. Esto último, alerta a los centros de control de infecciones de los hospitales generando estrategias de prevención en los mismos6,7. El diagnóstico rápido y preciso es esencial para mejorar los resultados de pacientes con ICD y para reducir la transmisión horizontal en las instalaciones de salud7,8.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han propuesto en los últimos años como método de elección para la detección de los genes que codifican la expresión de las toxinas A y B, así como también otros genes de importancia, por la facilidad y rapidez de la técnica, junto a la alta sensibilidad y especificidad9,10.
La caracterización molecular como la electroforesis de campo pulsado (PFGE) se ha utilizado como uno de los métodos genotípicos claves para subtipificar C. difficile encontrándose que es altamente discriminatoria, reproducible y ha permitido el seguimiento, la identificación de brotes y diseminación epidémica de cepas10,11. El método de Multilocus sequence Typing (MLST), es también recomendado por su relativa heterogeneidad genética, identificando 7 genes (aroE, ddl, dutA, tpi, recA, gmk, sodA) para analizar un grupo de aislados de C. difficile11,12.
En este estudio, se caracterizaron los aislamientos de C. difficile toxigénico, por métodos moleculares, susceptibilidad antimicrobiana y un estudio descriptivo de la caracterización epidemiológica del mismo año de estudio.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó un estudio retrospectivo de corte transversal, descriptivo tomando como periodo de estudio de enero a diciembre del 2019. Se incluyeron diferentes instituciones de salud del departamento Central y Capital. El muestreo realizado fue no probabilístico de casos consecutivos, como criterio de inclusión se consideraron pacientes hospitalizados de ambos sexos, de todos los rangos de edad, con presentación de síndrome diarreico postratamiento antimicrobiano, o recurrente de la infección por C. difficile o que presentaron alguno de los siguientes factores de riesgo: tratamiento inmunosupresor, enfermedades crónicas severas (renales y hepáticas), tratamiento con antiácidos, inhibidores de la bomba de protones, trasplantes, cirugías gastrointestinales y otros procedimientos invasivos en el tracto gastrointestinal, con fichas epidemiológicas completas y en los que se descartó que el síndrome diarreico sea de etiología bacteriana o viral.
Se realizó inicialmente un análisis epidemiológico de los datos demográficos y clínicos de los pacientes con la infección de C difficile. La extracción de ADN se realizó a partir de muestras de heces, con un pretratamiento con Buffer TE o Buffer S.T.A.R., y centrifugación, seguido por el método de perlas magnéticas con equipo de extracción de ADN automatizado de la marca Magpurix de procedencia Taiwán. La detección de C. difficile toxigénico se realizó por PCR en tiempo real, se utilizó el kit comercial de RIDA© que permite detectar el gen tcdA y tcdB juntos. El equipo utilizado fue Agilent Techn Mx3005P y la detección de los demás genes cdtA, cdtB, tcdE, tcdR, deleción del gen tcdC, se realizó por PCR en tiempo final, según el protocolo de Persson et al., 200813. En las PCR se utilizó como control positivo la cepa patrón C. difficile ATCC® 9689. Para las técnicas de PFGE y MLST se procedió según los protocolos de CDC 201414 y Griffiths et al., 2018 12 respectivamente.
Las muestras positivas, se sometieron a siembra para la recuperación de las cepas bacterianas, se realizó un pretratamiento con alcohol etílico al 100% y posteriormente siembra en Agar Cefoxitina-Cicloserina-Fructosa (CCFA), e incubación en ambiente anaeróbico estricto por 48 a 72 horas a 37 °C. Para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana, se evaluaron las concentraciones inhibitorias minimas (CIM) por el método epsilométrico de las drogas vancomicina y metronidazol, utilizando tiras de E-test para ambas drogas y la interpretación según criterios del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) documento M11-A7 2007 15. Para esta prueba se utilizó la cepa control Clostridium difficile ATCC® 9689.
El análisis estadístico se realizó por Epi Info versión 7 utilizando frecuencias con un índice de confianza de 95% (IC95), proporciones, medidas de tendencia central como: los promedios y medianas con rangos intercuartiles. Se tomaron en cuenta las normas éticas referentes a los estudios poblacionales, el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Laboratorio de Salud Pública del Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social según dictamen Nro. 162/2021.
RESULTADOS
De las 281 muestras estudiadas, la prevalencia de C. difficile toxigénico fue del 14% (IC 95%, 10-19%). Así mismo, el 86% (241/281) fueron muestras negativas y/o muestras positivas para C. difficile no toxigénico, que no presenta relevancia clínica.
La mediana de la edad de la población afectada con la ICD fue de 64 años con un rango de edad más prevalente de 51 a 70 años. El 60% de la población afectada fue del sexo masculino.
Las características clínicas en pacientes con ICD evaluadas más relevantes fueron en promedio: de 15 días de estancia hospitalaria, 5 días de síndrome diarreico y exposición previa a los antimicrobianos de 8 días.
Las áreas de internación más reportadas con pacientes con ICD fueron clínica médica, unidad de terapia intensiva, traumatología y geriatría.
El 94% (37/40) de los pacientes tuvieron tratamiento previo con antimicrobianos. Entre los antimicrobianos más utilizados se destacó a los betalactámicos en un 74%, dentro de estos el uso de cefalosporinas, carbapenémicos y betalactámicos con inhibidores de betalactamasas; vancomicina 28,8%, fluoroquinolonas 26% y clindamicina 15%. El 6% (3/40) restante correspondía a pacientes que presentaban algún tipo de inmunosupresión como casos oncológicos, quemados u hospitalización prolongada más de 15 días de internación.
Tabla 1. Frecuencia de cepas de Clostridioides difficile toxigénico según la presencia de toxinas.
| Toxinas | Frecuencia (n: 40) | Porcentaje % (IC 95) |
|---|---|---|
| Variantes de toxinas | ||
| tcdA+/tcdB+ | 40 | 100 (91,1 - 100) |
| tcdA+/tcdB- | ‹ 1 | - |
| tcdA-/tcdB+ | ‹ 1 | - |
| Toxina Binaria | ‹ 1 | - |
| cdtA+/cdtB+ | ‹ 1 | - |
| cdtA+/cdtB- | ‹ 1 | - |
| cdtA-/cdtB+ | ‹ 1 | - |
| Deleción tcdC | ‹ 1 | - |
| tcdR | 40 | 100 (91,1 - 100) |
| tcdE | 40 | 100 (91,1 - 100) |
Se pudo observar que de las cepas positivas de C. difficile toxigénico (40/40) presentaron la toxina A (tcdA) y toxina B (tcdB), tcdR y tcdE. Así mismo, ninguna de las cepas positivas presentó la toxina binaria (cdtA y cdtB) y tampoco mutación del gen tcdC (Tabla 1).
Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana para aislamiento de C. difficile (n: 40).
| Antimicrobiano | Rango CIM (mg/L) | Puntos de corte CIM (mg/L)* | Frecuencia (%) | ||||
| S | I | R | S | I | R | ||
| Vancomicina | 0.125-0.5 | ≤ 2 | - | ≥ 4 | 40 (100) | - | 0 (0) |
| Metronidazol | 0.016-256 | ≤ 8 | 16 | ≥ 32 | 40 (100) | 0 (0) | 0 (0) |
*Valores de punto de corte de CLSI CIM para anaerobios. CLSI, Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. CIM, concentración inhibitoria mínima; S, sensible; I, intermedio; R, resistente
De los resultados obtenidos, se pudo observar que las 40 cepas positivas para C. difficile toxigénico, el 100% presentó sensibilidad a ambas drogas.
Figura 1. Diversidad genética de las cepas de C. difficile toxigénico mediante Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE).
De 28 cepas, 19 presentaron perfiles únicos o perfiles genéticos que diferían entre sí. Al mismo tiempo, se pudieron detectar 7 perfiles clonales o clusters con un 90 - 100% de similitud. Se pudo constatar que las cepas clonales provenían de las mismas instituciones y correspondían a la misma unidad de internación. Esta comparación podría proponer la presencia y trasmisión de cepas clonales entre pacientes y mediada al mismo tiempo por el personal de salud. En cuanto al análisis del secuenciotipo, se encontró que la totalidad de cepas correspondían al ST35.
DISCUSIÓN
Se observó concordancia con la edad de la población afectada y otros estudios. Álvarez et al. encontraron que los pacientes presentaban una edad media de 63,4 años. Gardilicic et al. informaron que la mayoría de los pacientes afectados eran mayores de 65 años (77,7%). Fernández et al. describieron un estudio donde la edad media de los casos positivos fue de 72,9 años (edades comprendidas entre 47 a 88 años). Legaria et al. en un estudio realizado con pacientes sintomáticos observaron que las edades de los pacientes estaban entre 26 y 87 años, el 52% de ellos mayores de 64 años. Orrego et al. en un estudio realizado, observaron en 901 muestras una mediana de 68 años16-20).
Respecto a las características sociodemográficas se observó concordancia con la mayoría de los estudios16,21-25. La diferencia de la composición de la microbiota intestinal en personas mayores de 60 años predispone a agravar enfermedades crónicas de base, sumando a esto, el uso de antibióticos, hospitalizaciones prolongadas, etc.
Las características clínicas evaluadas, la mayoría de los estudios realizados, reportan la estancia hospitalaria prolongada, exposición a antimicrobianos prolongado, y la presencia de diarreas nosocomiales, como factores de riesgo clínicos presentes en la infección18,21,26-28. Respecto a las áreas de internación, se reportó una mayor concurrencia en las áreas de clínica médica, unidad de cuidados intensivos, geriatría, y traumatología. Esta alta concurrencia, se podría explicar, teniendo en cuenta, que estas áreas albergan pacientes con enfermedad crónica, además de hospitalización prolongada, tratamiento antimicrobiano extenso, pacientes inmunosuprimidos, de edad avanzada. Las diarreas nosocomiales por el uso de medicamentos son un factor de riesgo para la trasmisión intrahospitalaria de C. difficile y otros agentes microbianos. Esto explica las infecciones asociadas a la atención en salud entre pacientes de la misma unidad de servicio17,26,29.
El uso de antimicrobianos como vancomicina, carbapenémicos, fluoroquinolonas, cefalosporinas y piperacilina-tazobactam son los más utilizados tal como lo reportan diversos estudios16,23,24,30-32. Así mismo, se pudo observar un porcentaje de pacientes que no recibieron tratamiento antimicrobiano. Estos pacientes, eran inmunosuprimidos, por tratamiento quimioterápico, trasplantados o pacientes con quemaduras graves. Está descrito en la literatura que la inmunosupresión es un factor de riesgo para la aparición de ICD. Las manifestaciones clínicas más frecuentes en pacientes inmunosuprimidos son la diarrea de diversa gravedad y duración, sin embargo, no se presenta la característica de formación de pseudomembranas.
La presentación de las toxinas tcdE, tcdR, tcdA y tcdB coincide con los estudios realizados por Ferreira et al., Loo et al., Putsathit et al., Tian et al.20,32-34.
En cuanto a la sensibilidad antimicrobiana reportada respecto a las drogas de elección para el tratamiento, se encontró concordancia con otros estudios,17,32,35,36. Así mismo, se pudo observar, en el estudio de Pelaez et al.37, respecto a la droga metronidazol, una alta sensibilidad antimicrobiana en la mayoría de los países del mundo con excepción de Israel que, en el 2017, reportó una resistencia de 20,25% a este antimicrobiano, y a vancomicina, se observó un incremento de la resistencia en países como Estados Unidos, Polonia, Israel y Brasil, desde el 2011. Se destaca también que, en la mayoría de estos estudios citados, se presentan resistencias a otros antimicrobianos como clindamicina, fluoroquinolonas, entre otros, por lo que, sería interesante, realizar pruebas de sensibilidad a estas drogas para conocer la situación de la resistencia antimicrobiana respecto a estos antimicrobianos.
Los estudios de epidemiología molecular muestran en este trabajo, la presencia de varios perfiles electroforéticos únicos corroborando la circulación de varias clonas en los distintos hospitales. Así mismo la presencia de diferentes perfiles clonales circulando en la misma sala e institución que alerta la posibilidad de brotes en los distintos nosocomios. Varios estudios, han reportado, utilizar esta técnica, para el control de brotes y el reconocimiento de perfiles genéticos29,38,39.
Las técnicas utilizadas nos permitieron caracterizar este patógeno, determinando sus toxinas principales, además de la relación genética de las cepas asociadas a sus datos epidemiológicos. Los datos obtenidos revelan la necesidad de un mejoramiento en el sistema de control de infecciones, además, del fortalecimiento del sistema de vigilancia de la resistencia antimicrobiana para de esta manera evitar que surjan resistencias a los antimicrobianos que se utilizan actualmente.
Es de gran importancia extender el estudio a pacientes de la comunidad y establecer su relación con cepas hospitalarias a través de estudios filogenéticos, además, de profundizar el estudio de otros factores de virulencia que pudieran tener impacto en el establecimiento de la enfermedad y el perfil de resistencia a otras drogas no estudiadas.
