1. INTRODUCCIÓN

El cultivo de soja se introdujo en nuestro país en el año 1921, pero se expandió e intensificó recién en la década del 70 como resultado del incremento de la demanda internacional. A nivel mundial, Paraguay es considerado el quinto país productor de soja y el cuarto país exportador, antecediéndole Argentina, Estados Unidos y Brasil¹, siendo el principal rubro agrícola y una importante fuente de ingreso económico para el país.

El cultivo requiere una cantidad importante de nutrientes, como nitrógeno, fósforo y potasio, para lograr un adecuado crecimiento y rendimiento, los cuales se expresan en términos de kilogramos de nutrientes por toneladas de grano. Presenta un elevado contenido de nitrógeno en los granos y lo acumula en la planta en forma sostenida desde el estado de emergencia hasta el inicio de llenado de granos².

El nitrógeno es un nutriente esencial para las plantas, determina su crecimiento, contenido de proteínas y absorción de otros nutrientes. La deficiencia de este elemento genera clorosis, que se manifiesta con coloración amarillenta de tallos y hojas, falta de desarrollo y debilidad. Para ser empleado por las plantas debe pasar a su forma inorgánica como NO₃ ^- y NH₄ ⁺⁽³.

Los microorganismos capaces de fijar nitrógeno o diazótrofos son exclusivamente procariotas distribuidos en los dominios Archaea y Bacteria, con diferentes estilos de vida y metabolismos que incluyen: aerobios, anaerobios, heterótrofos, autótrofos, de vida libre y en simbiosis⁴. Hasta 1984, los rizobios se clasificaron en una familia, dos géneros y seis especies, en la actualidad con el avance de las técnicas de biología molecular ocurrió una revolución en la taxonomía quedando cuatro familias (Bradyrhizobiaceae, Hyphomicrobiaceae, Phyllobacteriaceae, Rhizobiaceae), seis géneros (Rhizobium, Mezorhizobium, Azorhizobium, Allorhizobium, Sinorhizobium y Bradyrhizobium) y más de 30 especies⁵.

Bradyrhizobium son bacilos Gram negativos de 0,5 - 0,9 µm por 1,2 - 3,0 µm, aeróbicos, no esporulados que se desplazan con un flagelo polar o subpolar, de crecimiento lento en medio manitol-extracto de levadura entre 5 a 7 días con colonias circulares blancas, beige o ligeramente rosadas, convexas, traslúcidas y con tendencia a presentar textura granulosa, no sobrepasan los 1 mm de diámetro y crecen a temperatura óptima de 25-30 ºC. Generan reacción alcalina y no producen 3-cetolactasa⁶. Dentro de este género se han descrito cuatro especies: B. japonicum, B. elkanii, B. liaoningense, que pueden nodular a G. max y B. yuanmingense que nodula Lespedeza cuneata pero no a G. max⁷.

Tanto la bacteria como la soja pueden vivir de forma independiente, pero cuando se asocian, ambos se ven favorecidos. La interacción lleva a la formación de un nuevo órgano en las raíces de las leguminosas, el nódulo, donde ocurre la fijación de nitrógeno. Está controlado por genes regulatorios y factores ambientales⁸.

Para satisfacer las necesidades de la demanda agrícola actual se requieren prácticas que permitan el uso adecuado de los recursos disponibles, en este caso el suelo; por lo que se da énfasis a la utilización de biofertilizantes o inoculantes como una herramienta que resulta beneficiosa para el ambiente. Los inoculantes son productos agro-biotecnológicos que contienen microorganismos vivos o latentes (bacterias u hongos) y que son agregados a los cultivos agrícolas para estimular su crecimiento y productividad. Enfocamos el interés en bacterias que habitan en la rizósfera y colonizan las raíces conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, PGPR por sus siglas en inglés, que promueven el crecimiento de las plantas incrementando el suministro o disponibilidad de nutrientes primarios como el nitrógeno, ya que es sabido que la soja requiere de una alta demanda de nitrógeno⁹.

El uso de inoculantes es una práctica agronómica reconocida a nivel mundial por sus beneficios productivos y económicos. Además, es una alternativa más ventajosa para el suministro de nutrientes a las plantas frente a la aplicación de fertilizantes químicos que conlleva un considerable aumento en los costos de producción, degradan el suelo y contribuyen a la contaminación. En nuestro país se ha reportado aplicación de inoculantes, provenientes en su mayoría de Argentina y Brasil, en el cultivo de soja notándose aumento del rendimiento frente a cultivos sin inocular¹⁰ en departamentos de la Región Oriental y se han realizado investigaciones sobre la diversidad genética y efectividad simbiótica de la población de rizobios aislados de nódulos de raíz de soja recolectados de los departamentos de Alto Paraná e Itapúa¹¹; en cuanto a la Región Occidental, se ha argumentado el uso de inoculantes en campos experimentales de la Cooperativa Chortitzer Ltda., localizada en el departamento de Boquerón pero no se han reportado estudios acerca de efectividad de los mismos o de aislamiento de microorganismos en la zona.

Teniendo en cuenta que los inoculantes utilizados para suministrar nutrientes al cultivo de soja están formulados con bacterias conocidas como rizobios, el trabajo de investigación se enfocará en la obtención de bacterias simbióticas del género Bradyrhizobium adaptadas a las condiciones edafoclimáticas del territorio chaqueño que resulten potencialmente efectivas para la fijación biológica de nitrógeno atmosférico para lo que se propone aislar y caracterizar morfológicamente bacterias del género Bradyrhizobium noduladoras de Glycine max provenientes de parcelas agrícolas de la localidad de Loma Plata, departamento de Boquerón.

2. MATERIALES Y MÉTODO

Fueron tomadas muestras de suelo de la localidad de Loma Plata-Chaco, departamento de Boquerón distante a 450 km de la ciudad de Asunción. Fueron seleccionadas tres parcelas agrícolas, extrayendo 20 kg de suelo a un nivel de 0-20 cm de profundidad que fueron transportadas al laboratorio en bolsas identificadas y refrigeradas. El análisis fisicoquímico del suelo fue llevado a cabo por responsables del Laboratorio de Suelos de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción ubicado en el Campus Universitario de la ciudad de San Lorenzo.

El trabajo de investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología del Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas (CEMIT) de la Universidad Nacional de Asunción, ubicado en el Campus Universitario de la Ciudad de San Lorenzo, Departamento Central.

Se realizó cultivo de plantas trampa¹² y para ello se prepararon 5 macetas de bolsas de polietileno de 20x20 cm para cada parcela a ser evaluada, totalizando 15 macetas. En cada una se sembraron 5 semillas de soja (G. max) totalizando 75 plantas para el estudio. Cuarenta días posteriores a la germinación se separaron las plantas de las macetas y fueron sumergidas en agua para retirar tierra adherida a las raíces. En los casos en que se verificó la formación de nódulos, estos fueron extraídos de las raíces, fueron cuantificados y medidos con el calibrador Vernier. La desinfección de nódulos se realizó según metodología sugerida por Somasegaran y Hoben, con el fin de eliminar trazas de hipoclorito de sodio y evitar contaminación por cualquier microorganismo diferente al género bacteriano de interés¹³. Los nódulos desinfectados fueron depositados en un tubo de ensayo esterilizado con 5 mL de solución salina estéril para ser macerados y sometidos a un agitador. Se extrajo 100 µL de la solución del macerado para sembrar en placas de Petri con agar manitol extracto de levadura-rojo Congo. Las placas fueron incubadas en estufa por diez días a 28 °C con observación diaria¹⁴.

Fueron seleccionadas aquellas colonias que presentaban características de Bradyrhizobium sp., teniendo en cuenta: forma, color, aspecto, borde, elevación, textura, consistencia y tamaño de colonias, así como la velocidad de crecimiento y absorción o no del colorante rojo congo. Se tomó como referencia la cepa N.F 1.4B, perteneciente al género Bradyrhizobium. Se hicieron repiques sucesivos de las colonias típicas en agar manitol extracto de levadura-rojo congo incubados a 28 ºC hasta obtención de cultivos puros¹⁴. Los aislados se sembraron en el medio de cultivo agar levadura lactosa (LLA), el cual tiene la misma formulación que el medio anterior pero se utiliza lactosa en lugar de manitol. El procedimiento implica la siembra de las cepas en el medio LLA y su posterior incubación por 10 días a 28 ºC. Luego del crecimiento se agrega al medio 10 mL de reactivo de Benedict y se observa si ocurre cambio de coloración del medio a los 10 minutos¹⁵. El ensayo se realizó por duplicado. Posteriormente se realizó coloración de Gram para validar la morfología bacteriana característica¹⁶, el cual se examinó en microscopio óptico con inmersión en aceite (100x). Las colonias seleccionadas como presuntivas de rizobios fueron repicadas en medio manitol-extracto de levadura con adición de colorante azul de bromotimol como indicador de pH (0,5%; pH: 6,8). Se incubaron por 7 días a 28 ºC¹⁶. El ensayo se realizó por duplicado.

3. RESULTADOS

Los resultados del análisis fisicoquímico realizado a las muestras de suelo de tres parcelas agrícolas dedicadas al cultivo de soja del Campo Experimental de la Cooperativa Chortitzer Ltda., describen al suelo con textura franco arenoso y arcilloso, pH ligeramente ácido a neutro, lo que resulta favorable para el desarrollo de los rizobios puesto que, según Soares et al., 2014, suelos muy ácidos pueden comprometer aspectos de la simbiosis con la leguminosa¹⁷; contenido de materia orgánica a nivel medio, cantidad de fosforo bajo, lo que podría no ser propicio teniendo en cuenta que el proceso de fijación biológica de nitrógeno requiere de una alta cantidad de energía, la cual es entregada en forma de moléculas de ATP (adenosín trifosfato), también tiene un rol importante en la formación del nódulo¹⁸ y cantidad de potasio alto, lo que resulta adecuado para mantener el crecimiento y funcionalidad de los nódulos según como expresan Düke et al., 1980¹⁹.

Del cultivo de plantas trampa (Figura 1), solo las provenientes de la parcela 3 demostraron características para la extracción de nódulos radiculares mientras que las correspondientes a las parcelas 1 y 2 no registraron formación de nódulos. Esto podría deberse a que en la parcela 3 se registra el uso de inoculantes mientras que en las demás parcelas no, lo que sugiere que la formación de nódulos no es debida a la presencia de rizobios nativos sino por rizobios adaptados a las características edáficas señaladas en el análisis fisicoquímico realizado y a las condiciones climáticas de la localidad de Loma Plata que incluye un clima semiárido con temperatura promedio anual de 25 ºC y precipitación media anual que ronda entre 600 a 800 mm según datos correspondientes a la Dirección de Meteorología e Hidrología²⁰. La posibilidad de obtención de cepas adaptadas es señalada por Lodeiro, 2015 como una condición favorable para que la formulación de los inoculantes proporcione mejores resultados en cuanto a simbiosis y fijación de nitrógeno²¹.

Figura 1 Cultivo de plantas trampa. A. Plantas de soja correspondientes a la parcela 1. B. Plantas de soja correspondientes a la parcela 2. C. Plantas de soja correspondientes a la parcela 3. 

Los nódulos extraídos fueron en su totalidad de forma esférica, que lo clasifica como

nódulo determinado característico de leguminosas tropicales como Glycine y Phaseolus²²; la coloración interna fue roja indicando la presencia de leghemoglobina y por tanto de bacterias activas como lo expresan en sus resultados Soto et al., 2012²³. Se obtuvo resultados variables de la cantidad de nódulos y el tamaño de los mismos, lo que dependería de mecanismos de autorregulación y de la presencia de nutrientes en el suelo como lo indican Frioni, 2005²⁴ y Coyne, 2000²⁵. En la Figura 2.A. se observa que los nódulos aislados presentan forma esférica con coloración marrón clara en la parte externa y en la interna resultó rojiza (Figura 2.B).

Figura 2 Aislamiento de nódulos. A. Nódulos radiculares aislados con forma esférica. B. Coloración interna rojiza de nódulos por presencia de leghemoglobina. 

La cantidad de nódulos aislados por maceta fue variable, entre 2-30 nódulos/raíz; el diámetro promedio de los mismos también fue variable, entre 2-4 mm con distribución tanto en raíces principales como en las secundarias. Las repeticiones de cada parcela dio número variable de plantas desarrolladas, muchas germinaron pero no llegaron a prosperar y se secaron. Las plántulas vivas desarrollaron nódulos, en números variables, registrados en la Tabla 1.

Los aislados fueron sembrados en agar manitol extracto de levadura-rojo congo. A partir de esto, se obtuvieron 4 aislados y se les denominó: C1, C4, C7 y C11, que resultaron ser bacilos Gram negativos (Figura 3).

También fueron sembrados en medio agar levadura lactosa (LLA). Este medio permite reconocimiento de presencia de azúcares que son liberados a partir de la enzima cetolactasa. Se pudo comprobar la ausencia de contaminante ya que no se observó cambio de coloración del medio tal y como lo expresan Sosa et al., 2004, donde utilizaron esta prueba para descartar presencia de microorganismos pertenecientes al género Agrobacterium¹⁵.

Figura 3 Bacilos Gram negativos. Morfología bacteriana característica. Aumento: 100X. 

El análisis de los 4 aislados incluyó primeramente la velocidad de crecimiento que se dio en 6 días, por lo que se clasifica a los aislados como rizobios de crecimiento lento según las categorías establecidas por Marquina et al., 2011²⁶. En cuanto a las características morfológicas de las colonias, los aislados C1, C4, C7 Y C11 presentaban colonias circulares de menos de 1 mm, rosáceas, traslúcidas, enteras, convexas, granulosas y mucosas; resultados similares se observan en el trabajo realizado por Cuadrado et al., 2009, en donde con base a estos parámetros agruparon a 33 cepas de sus aislados dentro del grupo II o Bradyrhizobium²⁷. Los mismos autores señalan que sometieron a sus cepas aisladas a coloración de Gram, en donde las colonias seleccionadas estaban formadas por bacterias Gram negativas de tipo bacilar lo que coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. Las características mencionadas también fueron observadas en una cepa de referencia N.F 1.4B (Tabla 2, Figura 4).

Figura 4 Crecimiento de colonias en medio 79. Se observan colonias circulares, rosáceas, de menos de 1 mm de diámetro, con borde entero y de textura granulosa. 

4. CONCLUSIONES

Se logró obtener cuatro aislados de rizobios noduladores de Glycine max provenientes de parcelas agrícolas del campo experimental de la Cooperativa Chortitzer Ltda. ubicadas en la localidad de Loma Plata, departamento de Boquerón. Según sus características morfológicas podrían ser clasificadas dentro del género Bradyrhizobium.

Las bacterias fueron aisladas a partir de nódulos radicales provenientes de la leguminosa Glycine max, obtenidas por cultivo de plantas trampa en muestras de suelo procedentes de la parcela agrícola 3 del campo experimental, en donde se argumenta el uso de inoculantes para el cultivo de soja por lo que los rizobios estarían adaptados a las condiciones edafoclimáticas de la zona.

A partir de los cultivos puros, se identificó las colonias de bacterias teniendo en cuenta características morfológicas que pertenezcan al género Bradyrhizobium, como ser forma, color, aspecto, borde, elevación, textura, consistencia y tamaño de colonias, además de la velocidad de crecimiento, absorción o no del colorante rojo congo y la producción de álcali para complementar la caracterización.

Los aislados obtenidos se constituyen en potenciales insumos para la producción industrial local de inoculantes para el cultivo de soja en la zona de Chaco Central.