ENFERMEDADES DESATENDIDAS

Las enfermedades conocidas como tropicales desatendidas (Neglected Tropical Diseases o NTD por sus siglas en inglés) son consideradas como un grupo variado de enfermedades que abundan en 149 países con climas tropicales y subtropicales, afectando a más de mil millones de personas y representan una inversión de millones de dólares anuales para los países en desarrollo. Las poblaciones más afectadas incluyen a aquellas de escasos recursos y condiciones de vida inadecuadas, muchas veces en constante contacto con los vectores que las transmiten y los animales que actúan como reservorios¹.

Entre las enfermedades causadas por parásitos flagelados con amplia distribución en las Américas clasificadas como desatendidas, pueden citarse la enfermedad de Chagas y la Leishmaniasis². La leishmaniasis es causada por parásitos del género Leishmania, transmitida por la picadura del vector flebotomíneo infectado. La mayoría de los casos se concentran en Brasil, Colombia y Perú³.

Por otro lado, la enfermedad de Chagas es causada por el parásito Trypanosoma cruzi y transmitida por vectores triatominos. Es considerada la enfermedad tropical transmisible más prevalente en América Latina. La distribución geográfica de la infección de Chagas se extiende desde el sur de los Estados Unidos hasta el sur de Argentina y Chile⁴.

El panorama altamente complejo de estas enfermedades en países en vías de desarrollo se ve agravado por la falta de inversión en la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas opcionales a las convencionales, las cuales presentan severos efectos adversos en los pacientes, quienes acaban desistiendo del tratamiento, aumentando así el riesgo del desarrollo de resistencia del parásito. En el caso particular del Chagas, el medicamento es ineficiente cuando la enfermedad se encuentra en su fase crónica².

El control y tratamiento de enfermedades tropicales desatendidas representan un gran desafío para grupos de investigación, sistemas de salud y gobiernos, que deben promover acciones de integración social, asistencia a la salud e incentivo al desarrollo científico y tecnológico, con el objetivo de minimizar los agravios asociados a estas molestias. Estas enfermedades, además de afectar a millones de personas en situación de vulnerabilidad, presentan implicaciones económicas asociadas al tratamiento que son igualmente relevantes, como a la propia enfermedad⁶.

De esta manera surge la necesidad de adoptar nuevos medicamentos alternativos o combinatorios para su aplicación en el tratamiento de estas dolencias. Pero, ¿cuáles son las opciones disponibles cuando se plantean estas alternativas a tratamientos que poseen más de cincuenta años de implementación?

NUEVOS ENFOQUES TERAPÉUTICOS Y BLANCOS MOLECULARES EN TRIPANOSOMÁTIDOS

El desarrollo de nuevos tratamientos contra protozoarios sigue principalmente tres líneas: (i) reposicionamiento de fármacos que se encuentran en el mercado para otros fines utilizando herramientas virtuales o nuevas combinaciones de los que tienen acción conocida, (ii) análisis de las vías metabólicas del parásito para identificar nuevos objetivos moleculares y posterior desarrollo de compuestos con posible acción sobre ellos, y (iii) sobre productos naturales como fuente potencial⁶.

Todos los medicamentos actualmente disponibles para el tratamiento de enfermedades parasitarias surgieron a partir del tamizaje (“screening”) contra los parásitos en cultivo, ensayados contra linajes celulares, pasando los más prometedores a ser evaluados in vivo y en ensayos preclínicos y clínicos. Por otro lado, los avances en relación a la comprensión de los mecanismos moleculares de enfermedades parasitarias, así como de las características fisiológicas, bioquímicas y genéticas de los parásitos, permitieron el desarrollo de una nueva estrategia de diseño racional de fármacos, basándose en las diferencias estudiadas entre huésped y parásito y dirigido contra blancos específicos presentes en este último. Esta área, desarrollada mediante las herramientas biomoleculares (biología molecular, bioquímica, genética, etc.), ha aumentado el número de blancos moleculares para pruebas en screening de alto rendimiento para identificación de agentes innovadores en las últimas décadas⁷.

Los blancos moleculares se definen como aquellas proteínas o ácidos nucleicos cuya actividad biológica es específica de un organismo y que pueden ser susceptibles a la acción de compuestos o moléculas con la capacidad de alterar sustancialmente su actividad. En este mismo ambiente, conceptualmente, los inhibidores se definen como moléculas capaces de enlazarse a un objetivo específico bloqueando su actividad. En cuanto a los blancos moleculares de enfermedades desatendidas, los criterios básicos para la selección de los mismos son que se presenten prioritariamente en el agente etiológico y que se expresen en la etapa de vida patógena para el huésped⁸.

Aunque la inversión en investigación y desarrollo farmacéutico ha aumentado substancialmente, la falta de un aumento correspondiente en la identificación de nuevas moléculas con aprobación para terapéutica, indica que la innovación farmacéutica sigue siendo un desafío para los grupos de investigación⁹.

La búsqueda de nuevas alternativas quimioterapéuticas en la lucha contra las enfermedades desatendidas causadas por parásitos ha conducido a los investigadores al estudio de diversos blancos moleculares, algunos de ellos inclusive compartidos entre los organismos componentes de la familia Trypanosomatidae (Tabla 1).

Como ya ha sido mencionado, entre los principales criterios para la validación de un blanco molecular se encuentra que el mismo sea crucial para el metabolismo del patógeno, prefiriéndose si está presente exclusivamente en el parásito. Sin embargo, algunos fármacos no siguen este patrón, derivando en los efectos adversos y la baja eficiencia⁸. Entre los blancos más estudiados presentes en esta familia de parásitos, las enzimas del metabolismo tiol-dependiente son consideradas entre las más prometedoras^7,10. Los tripanosomátidos están expuestos a una cantidad considerable de productos tóxicos denominados especies reactivas de oxígeno y especies reactivas de nitrógeno (ROS y RNS por sus siglas en inglés, respectivamente) durante su paso por las células del hospedero. Estos agentes pueden causar un desbalance del sistema reductor intracelular ocasionando serias alteraciones al parásito. El agrupamiento tiol presente en diversos complejos enzimáticos cumple un papel determinante en la reducción de las ROS, regulando en este proceso otras funciones celulares¹¹. En particular, en los miembros de la familia Trypanosomatidae existe un sistema a base de tripanotiona [T(S)2] que junto a la flavoenzima Tripanotiona Reductasa, proporcionan las condiciones adecuadas para su supervivencia¹².

El sistema de la Tripanotiona Reductasa fue comprendido varios años después de haberse descrito la existencia de otros componentes de la vía metabólica donde ella actúa, sabiéndose hasta ese momento que se trataba de un sistema imprescindible para la supervivencia del parásito¹¹.

Los componentes descritos posteriormente incluyen la Triparedoxina Peroxidasa y la Triparedoxina, que convierten los radicales peróxido y alquilo hidroperóxido en agua y alcohol, respectivamente¹⁷.

La presencia de la Tripanotiona Reductasa (TR) (BRENDA: EC: 1.8.1.12) en varios flagelados de la familia Trypanosomatidae fue demostrada inicialmente en estudios utilizando el sustrato tripanotiona de Crithidia fasciculata, y posteriormente, la enzima fue identificada en estudios utilizando extractos solubles de Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, L. mexicana, y Crithidia fasciculata^18,19. Estos estudios condujeron a la determinación de la función de la ditiol tripanotiona (forma reducida de la tripanotiona), que conjuntamente con la TR, proporcionan el ambiente reductor en los tripanosomátidos sustituyendo el sistema del glutatión (GSH) y la Glutatión Reductasa (GR) (EC: 1.8.1.7) que se encuentra en el hospedero mamífero²⁰.

A pesar de que la GR y de la TR presentan aproximadamente 40% de identidad en su secuencia de aminoácidos, existen características estructurales que proporcionan la especificidad respectiva de unión por sus sustratos. Un detalle importante en este punto es la diferencia de cargas, tamaño y bolsones hidrofílicos e hidrofóbicos presentes en las dos enzimas. En este contexto, la TR posee la capacidad de acomodar sustratos constituidos por grupos con mayor volumen, presentando un sitio activo cargado negativamente y regiones hidrofóbicas interactuando con su substrato mediante interacciones electrostáticas y de van der Waals, respectivamente, a diferencia de la GR que presenta residuos cargados positivamente e interactúa con su sustrato de menor tamaño por interacciones electrostáticas^11,21,22.

Figura 1: Vía metabólica de la enzima Tripanotiona Reductasa¹⁷. 

Esta diferencia ha establecido a la TR como un blanco validado para el diseño racional de fármacos contra la enfermedad de Chagas y Leishmaniasis. Estudios anteriores demostraron que esta enzima y otras que pertenecen a la misma ruta metabólica, se encuentran sobre-expresadas en las cepas de parásito que son resistentes a los medicamentos convencionales, sugiriendo que esta vía puede ser considerada un objetivo apropiado para el desarrollo de nuevos fármacos^23,24.

Desde la identificación de la enzima TR, las investigaciones han abordado la búsqueda de inhibidores con el fin de interferir en el ciclo de vida de estos flagelados. En este contexto, algunos estudios han descrito la capacidad inhibitoria de la TR por el fármaco clomipramina, registrado como antidepresivo tricíclico clásico. Inicialmente este efecto fue relacionado con un desequilibrio en el gradiente electroquímico de las membranas de los parásitos, sin embargo, trabajos posteriores realizados con una TR recombinante y ensayos in silico indicaron su conexión con la inhibición de esta enzima^25,26. A partir de ese trabajo inicial, se ha descrito la acción inhibitoria de otros derivados de compuestos tricíclicos^27,28).

Debido al escenario que involucra estas enfermedades olvidadas, la biodiversidad surge como una fuente de moléculas de alta variabilidad estructural, química y de alto potencial de aplicación biotecnológica.

Tradicionalmente, los productos naturales representan una fuente de moléculas con potencial uso contra enfermedades, ya sea de forma empírica con el uso popular o aplicado en la medicina. Los compuestos de origen natural como fuente de agentes terapéuticos alcanzaron su pico en la década de 1970-80. Entre 1981 y 2002, aproximadamente la mitad de las nuevas entidades químicas registradas corresponden a moléculas de origen natural²⁹ y hasta el 34% de los medicamentos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) hasta 2010, derivaron de esta importante fuente^((29,30.

Gracias a los considerables avances en la comprensión de las vías de biosíntesis de estas moléculas, junto con mejoras en los enfoques para su aislamiento, identificación y caracterización, se han desarrollado las herramientas necesarias para una nueva era en la investigación de productos naturales en la academia y en la industria³¹.

ESTUDIOS IN SILICO PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVAS MOLÉCULAS CON POTENCIAL FARMACOLÓGICO

La identificación de entidades innovadoras es el objetivo central de la investigación en la búsqueda de nuevos fármacos y este proceso puede ser realizado utilizando herramientas de screening de alto rendimiento (High-Throughput Screening-HTS). A pesar de haber sido establecida alrededor de los años 80, el costo de implementación de estas plataformas sigue siendo un gran impedimento, disminuyendo su aplicabilidad en regiones de escasos recursos. En este sentido, la utilización de plataformas virtuales ofrece ventajas interesantes en la búsqueda de moléculas con capacidad de interacción con un objetivo molecular validado. El tamizaje (“screening”) virtual o clasificación virtual aplicado a farmacología consiste en el uso de algoritmos matemáticos computacionales que permiten seleccionar entre un grupo de moléculas sometidas al análisis de interacción contra blancos seleccionados, aquellas que presentan mayor probabilidad de actividad en modelos experimentales in vitro e in vivo³².

Inicialmente, la selección virtual fue considerada como una alternativa ante la falta de infraestructura de algunos laboratorios para implementar metodologías de HTS, pero posteriormente, ambas técnicas fueron consideradas complementarias, siendo el screening virtual conocido como la versión in silico del screening de alto rendimiento³².

Los análisis de clasificación virtual pueden seguir dos metodologías igualmente válidas dependientes de los datos disponibles: la basada en la estructura del ligando (cuando no se cuenta con la estructura del receptor) o aquella que considera la estructura del receptor, conocida como acoplamiento (“docking”) molecular³³.

El desarrollo de las técnicas de secuenciamiento del ácido desoxirribonucleico (ADN) y de expresión y caracterización estructural de proteínas contribuyó notablemente en las áreas de investigación que apuntan a la identificación de potenciales fármacos. En relación a la estructura tridimensional, para una parte de las moléculas existe una estructura resuelta, obtenida por cristalografía y análisis por difracción de rayos X y/o resonancia magnética nuclear³⁴.

Por otra parte, cuando no se dispone del modelo adecuado para realizar la selección virtual, se tiene como alternativa el modelado por homología del blanco de interés. Una de las principales justificaciones para la utilización de esta herramienta se basa en la observación de que en la naturaleza las proteínas son más conservadas en su estructura tridimensional que en relación a su secuencia de aminoácidos³⁵.

Una vez obtenido el modelo tridimensional del receptor, es posible realizar el docking molecular, confrontando el modelo en condiciones específicas con los ligandos que serán ensayados. Posteriormente, son seleccionadas aquellas moléculas que presentaron interacciones más favorables en términos de estabilidad molecular del complejo receptor-ligando³⁶.

La principal ventaja del screening virtual es la disminución drástica de tiempo y recursos requeridos para ensayar una biblioteca de compuestos. La identificación de entidades que no interactúan con el blanco estudiado reduce notablemente el número de moléculas susceptibles de ser ensayadas in vitro, siendo ésta la diferencia que se presenta cuando se compara con la técnica del HTS, en la cual innumerables compuestos se prueban sin información previa acerca de los potenciales efectos de los mismos³⁷.

Las primeras investigaciones de interacción molecular entre ligandos y receptores se realizaron considerándolos como estructuras fijas. Actualmente, se proponen moléculas interactuando de una manera dinámica, sufriendo cambios conformacionales derivados de esa interacción y que afectan a su funcionalidad. Si bien el docking molecular puede proporcionar datos importantes sobre el comportamiento de una molécula en presencia de otra, existen factores que no se consideran a la hora de realizar un análisis in silico, principalmente el hecho de que la presencia aislada de las dos moléculas no refleja la realidad de los ambientes naturales. Aunque este parámetro es considerado un aspecto del método a ser mejorado, información valiosa puede ser rescatada de los ensayos realizados de forma virtual, representando una herramienta inestimable en la búsqueda de fármacos y moléculas con actividad contra posibles blancos terapéuticos³⁶.

CONCLUSIÓN

Considerando la situación actual de la Leishmaniasis y la enfermedad de Chagas, el control y tratamiento de estas enfermedades representa un gran desafío que estimula el trabajo conjunto de grupos de investigación y sistemas de salud, lo cual debe propiciar el desarrollo tecnológico y científico con el objeto de minimizar las complicaciones asociadas a estas dolencias. Son de especial interés la aplicación de herramientas que permitan el diseño de metodologías capaces de reducir costos a largo plazo. En este contexto, los ensayos in silico disminuyen de manera considerable el número de moléculas a ser evaluadas en ensayos biológicos, fomentando la iniciativa de aplicar nuevas estrategias basadas en la disponibilidad de recursos.